細(xì)胞技術(shù)范文精選

一、資料與方法

1、挑選本院2010年6月至2012年12月送檢病理科支氣管鏡刷檢細(xì)胞學(xué)標(biāo)本252例。所有的患者最后均確診為肺癌。男184例，女68例，年齡44～85歲，(平均66．3歲)。所有的患者行支氣管鏡刷檢，同時(shí)薄層液基細(xì)胞學(xué)涂片與傳統(tǒng)涂片。

2、儀器:美國SurPathTMPrepstain全自動(dòng)液基薄層細(xì)胞制片染片機(jī)(BDTriPath，BurlingtonNC，USA)及相關(guān)耗材。采用奧林巴斯電子支氣管鏡(BF-260或1T260工作鏡)進(jìn)行檢查。鏡下發(fā)現(xiàn)肺癌的直接征象或間接征象者，根據(jù)胸部CT提示的病變行透視下支氣管鏡肺活檢。所有患者均在活檢部位采用南京微創(chuàng)一次性保護(hù)型細(xì)胞刷刷檢，將毛刷頭直接在玻片上常規(guī)涂片1張。再將毛刷頭置于盛有10mlCyteRichRed固定液的50ml離心管中充分震蕩漂洗收集細(xì)胞。

3、制片方法

3.1傳統(tǒng)涂片方法:纖維支氣管鏡刷頭直接涂抹于載玻片上，涂片1張，干燥，95%乙醇固定10min，常規(guī)HE染色鏡檢。

3.2BDTriPath制片方法:標(biāo)本加入專用50ml離心管中，使用程控離心機(jī)以Hettich3#程序600r/min離心10min，迅速管架倒置180°傾出上清液，加入CyteRichRed固定液20ml，靜置30min，Hettich的3#程序以600r/min離心10min，迅速管架倒置180°傾出上清液，渦漩混合器振蕩均勻，加入10mlTris緩沖液，混均，移至12ml的離心管，Hettich的4#程序以600r/min離心5min，迅速管架倒置180°傾出上清液，渦漩混合器振蕩(15±5)s。管架放在PrePStain系統(tǒng)上，靜置10min，等待上機(jī)自動(dòng)制片染色。

1PD的環(huán)境及職業(yè)致病因素

1.1金屬元素

有研究發(fā)現(xiàn)，某些重金屬，比如錳的慢性中毒可損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，特別是紋狀體和蒼白球等部位，產(chǎn)生類似PD的錐體外系神經(jīng)功能障礙。Guilarte等及Huang的研究也發(fā)現(xiàn)錳中毒與PD有著密切的聯(lián)系。Park發(fā)現(xiàn)電焊工及其他長期暴露于錳的工人存在著出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和罹患PD的危險(xiǎn)性。Moberly等的研究還表明，錳可以通過作用于嗅球和基底神經(jīng)節(jié)的多巴胺能神經(jīng)元來影響神經(jīng)介質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致PD等錐體外系疾病的發(fā)生。Coon等利用K-XRF技術(shù)測(cè)量了慢性暴露條件下鉛在人體內(nèi)的沉積量，并表明長期的鉛暴露與PD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)成正相關(guān)。Komatsu等證實(shí)了錳、鐵、鉛、鎘、鋁等金屬在體內(nèi)的沉積會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加，從而引起PD的發(fā)生。

1.2農(nóng)藥百草枯

對(duì)多巴胺系統(tǒng)具有神經(jīng)毒性作用，從而導(dǎo)致PD樣癥狀和改變。Betarbet等利用魚藤酮復(fù)制出了類似PD的大鼠模型，其癥狀包括出現(xiàn)震顫、步態(tài)不穩(wěn)等。某些PD患者的腦組織中所含有機(jī)氯農(nóng)藥，如林丹、狄氏劑的水平明顯高于對(duì)照組。代森錳（一種殺真菌劑）也被報(bào)道與PD的發(fā)生相關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)磷農(nóng)藥同樣與PD的發(fā)病相關(guān)。

1.3環(huán)境毒素

一、材料與方法

1實(shí)驗(yàn)對(duì)象及樣品制備本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為半年內(nèi)未接受過輸血的健康中國人12名，抽取靜脈血5ml，使用ABO血型檢測(cè)試劑檢測(cè)其ABO血型。其中A型血2人，B型血6人，O型血3人，AB型血1人，RhD血型均為陽性。樣品制備人員將A、B、O血型相同且測(cè)定的8種血型抗原至少有2種不相同的單一血樣制備成體外混合血樣。混合血樣依據(jù)紅細(xì)胞數(shù)按一定比例混合，混合比例分別為95％／5％、97％／3％、98．5％／1．5％、99．5％／0．5％，各比例混合血樣的例數(shù)分別為8例，8例，8例，10例。樣品制備人員將所有單一和混合血樣編號(hào)后發(fā)放給檢測(cè)人員進(jìn)行檢測(cè)分析。

2儀器和試劑本實(shí)驗(yàn)所用檢測(cè)儀器為美國BeckmanCoulter公司生產(chǎn)的FC500型號(hào)流式細(xì)胞儀。使用抗體為瑞士DiaMed公司生產(chǎn)的單克隆抗體產(chǎn)品，以及SEROTEC公司生產(chǎn)的FITC熒光標(biāo)記的羊抗人免疫球蛋白。

3實(shí)驗(yàn)方法用細(xì)胞穩(wěn)定液將EDTA抗凝的新鮮血稀釋后，加入單克隆抗體，使之與相應(yīng)的紅細(xì)胞表面抗原結(jié)合，并用熒光素標(biāo)記的示蹤抗體標(biāo)記紅細(xì)胞表面抗原抗體復(fù)合物。使用流式細(xì)胞儀對(duì)紅細(xì)胞表面特定血型抗原的表達(dá)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。通過對(duì)此方法檢測(cè)的特異性和靈敏度、信噪比和污染攜帶率、檢測(cè)樣品穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性等方面的檢測(cè)，驗(yàn)證流式細(xì)胞儀檢測(cè)異體血液回輸方法的準(zhǔn)確性和可操作性。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1抗原檢測(cè)特異性和靈敏度經(jīng)檢測(cè)，這46例血樣的檢測(cè)判定結(jié)果為：12例單一血樣全部被檢出單峰并被準(zhǔn)確判為陰性。8例95％／5％和8例97％／3％比例混合的血樣均被檢測(cè)出兩個(gè)以上雙峰，所有應(yīng)為混合雙峰的樣品均被準(zhǔn)確檢出；8例98．5％／1．5％比例混合的血樣在應(yīng)出現(xiàn)雙峰的樣品圖中能被識(shí)別為雙峰，但個(gè)別抗體雙峰分離效果不佳，需進(jìn)行抗體優(yōu)化程序后方能被判定為雙峰；10例99．5％／0．5％比例混合的血樣中，只有4例樣品被判斷為含2個(gè)以上雙峰，其他混合樣品由于混合比例低于抗體檢測(cè)限而無法判定。

1資料與方法

1.1一般資料

患者的入選是根據(jù)美國胸科協(xié)會(huì)制定的診斷指南，存在大于3周以上的咳嗽癥狀，有至少一條哮喘癥狀，并且體格檢查出現(xiàn)相應(yīng)體征的兒童患者隨機(jī)納入研究，研究時(shí)間從2012年1月～2014年6月。

1.2方法采用

流式細(xì)胞術(shù)。所收集樣本冷凍保存，統(tǒng)一檢測(cè)，末梢血樣采集于肝素鈉抗凝管中，取100μL血樣加入中含有20μL白介素-3的緩沖液中，室溫孵育10min，然后加入100μL兒童哮喘患者或健康對(duì)照組的血清，室溫孵育20min，其中緩沖液包含0.12MNaCI，0.005MKCI，0.025MTris，pH7.6。N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸（fMLP0.4mmol/L）（Sigma-Aldrich公司，圣路易，MO，USA），一種非特異性細(xì)胞活化劑，被用于陽性對(duì)照，洗滌緩沖液（0.01M磷酸緩沖鹽水包括0.01M的磷酸二氫鈉，0.01M磷酸氫二鈉，pH為7.2～7.4）被用于陰性對(duì)照。孵育結(jié)束后將樣品置于冷卻的冰上防止嗜堿性粒細(xì)胞活化和降解，繼而與熒光FITC結(jié)合的抗CD63抗體孵育BectonDickinson，F(xiàn)ranklinLakes，NJ，USA），與熒光PE結(jié)合的抗IgE抗體（Pharmacia，Uppsala，Sweden），以及PerCP結(jié)合的抗CD45抗體（BectonDickinson）避光孵育20min，加入紅細(xì)胞溶解液。2500rpm離心10min，將沉淀用緩沖液懸浮，BDFACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。在采集過程中，紅色熒光（FL2）和前向散射（FSC）和側(cè)向角散射（SSC）的特點(diǎn)是采用至少1000嗜堿性粒細(xì)胞的表達(dá)高IgE介導(dǎo)的面密度的選框進(jìn)行分析，使用FSC/SSC特性淋巴細(xì)胞的定義。然后，從這些細(xì)胞，F(xiàn)L3/FL2圖上嗜堿性粒細(xì)胞的認(rèn)定為CD45低/IgE的高表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1iPSC技術(shù)

經(jīng)典的iPSC技術(shù)路線主要包括以下步驟:①選擇宿主細(xì)胞;②選擇外源重組因子;③重組因子導(dǎo)入宿主細(xì)胞;④重編程產(chǎn)生iPSC;⑤iPSC的鑒定及分化。

1．1宿主細(xì)胞來源Yamanaka將小鼠體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC開啟了該技術(shù)的先河，之后人、大鼠、猴、豬、綿羊，甚至一些瀕危動(dòng)物的iPSC系紛紛建立。就人類而言，目前已從皮膚成纖維細(xì)胞、角質(zhì)成形細(xì)胞、羊水、神經(jīng)前體細(xì)胞、外周血細(xì)胞，甚至尿液中獲得iPSC。不同組織來源細(xì)胞重編程效率及所需因子不同。不僅iPSC分化能力因人而異，在表觀遺傳穩(wěn)定性和癌基因的表達(dá)方面也存在男女有別現(xiàn)象。使得iPSC技術(shù)應(yīng)用于臨床個(gè)體治療更具挑戰(zhàn)性。

1．2重組因子的選擇及導(dǎo)入方式經(jīng)典的Yamanaka因子在癌細(xì)胞中存在超表達(dá)、整合型載體可導(dǎo)致插入突變，且誘導(dǎo)效率非常低。因此，iPSC研究者一直致力于尋求更安全、簡(jiǎn)單、有效的誘導(dǎo)策略。Anokye-Danso等應(yīng)用微RNA調(diào)控技術(shù)，不使用轉(zhuǎn)錄因子高效誘導(dǎo)iPSC。Zhou等和Kim等分別利用Yamanaka四因子的融合蛋白和穿膜肽與轉(zhuǎn)錄因子蛋白的融合蛋白，直接誘導(dǎo)受體細(xì)胞為iPSC，但效率較低。一些學(xué)者利用腺病毒、質(zhì)粒載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，或利用Cre/LoxP系統(tǒng)、oriP/EBNAI系統(tǒng)及piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將外源基因整合后再特異性切除，從而得到不含外源基因整合的iPSC，但是存在基因重排及效率低下現(xiàn)象。而一些小分子化合物(如丙戊酸、曲古抑菌素A、維生素C、篩選激酶抑制劑、BIX-01294、5-AZA、Wnt3a、Zscan4因子)的應(yīng)用可顯著提高iPSC的產(chǎn)生效率。

1．3iPSC的誘導(dǎo)分化Zhao等利用iPSC通過四倍體囊胚注射得到存活并具繁殖能力的小鼠，證明了iPSC的全能性。目前，人們已成功地將iPSC在體外定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、耳蝸毛細(xì)胞、色素細(xì)胞等類型細(xì)胞。

1．4iPSC機(jī)制相關(guān)研究突破研究人員長期受困于體細(xì)胞重編程的具體機(jī)制。Polo等繪制出體細(xì)胞重編程為iPSC的分子線路圖，證實(shí)誘導(dǎo)過程引起了兩次轉(zhuǎn)錄波，分別是由c-myc/Klf4和Oct4/Sox2/Klf4驅(qū)動(dòng)，并確定了重編程過程中路障基因。基于iPSC技術(shù)已證明細(xì)胞的分化過程并非不可逆轉(zhuǎn)，研究人員利用細(xì)胞直接重編程技術(shù)將已分化細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成特定譜系的細(xì)胞，利用間接譜系轉(zhuǎn)化技術(shù)部分去分化生成多潛能祖細(xì)胞，為干細(xì)胞研究開辟了新思路。