楊萬里的詩

前言：想要寫出一篇令人眼前一亮的文章嗎？我們特意為您整理了5篇楊萬里的詩范文，相信會為您的寫作帶來幫助，發現更多的寫作思路和靈感。

楊萬里的詩范文第1篇

原詩：坐看深來尺許強，偏於薄暮發寒光。半空舞倦居然嬾，一點風來特地忙。

落盡瓊花天不惜，封它梅蕊玉無香。倩誰細橪成湯餅，換卻人間煙火腸。

譯文：坐看落雪，其深已一尺有余，更在這黃昏時分發散著縷縷寒光。雪花在半空中舞到疲倦，顯得輕柔無力，然而些許微風吹過，又翩然起舞。上天渾然不憐惜，讓瓊花似的雪落盡，將梅蕊、海棠的封存在冰雪之下，花香杳無。有誰能將這高潔的雪做成湯和餅，來滌蕩人們滿是人間煙火的腸胃。

（來源：文章屋網 ）

楊萬里的詩范文第2篇

在此對其賠償金額之三次變數暫且不提，單說說這5萬元的獎勵吧。

既是獎勵，自然有獎勵的理由。在管理心理學中，獎勵是對人的某種行為給予肯定與表揚，使人保持這種行為。那么，參照鐵路系統對于罹難者的獎勵，大抵可以歸納為對罹難者家屬的某種行為給予肯定與表揚了。然而，這似乎并不符合邏輯。罹難者家屬的什么行為引發了鐵路系統的肯定繼而表揚呢？且肯定與表揚之下，讓惜金如命的鐵路系統不惜以5萬元的“重金”進行獎勵呢？

罹難家屬幫忙救人了？并不是。罹難者幫鐵路系統發現了安全隱患，繼而獎勵其家屬？說不通。那么，可能存在的原因便是：家屬提前簽訂賠償協議，使得鐵路系統在此次事故中應該承擔的責任變小了，其在事故中的錯誤造成的整個系統的壓力變小了，總而言之，鐵路系統在事故中最重要的麻煩變少了，這就需要獎勵。

當然“獎”遠遠不夠，尚需要“勵”！不僅此次不要惹太多麻煩，下次、下下次，以后更多次，（我當然希望這是最后一次，但是，您信嗎？）不要再發生此類事故之后給當事單位惹麻煩，這就是獎勵機制，通過這種獎勵來減少壓力、解脫自己。這不能不說是利用人最寶貴的生命來換取“平安符”的丑惡做法，表面是增加了賠償，實則是輕視生命、不尊重生命的表現。其用心之險惡，“獎勵”二字可見一斑！

獎勵這個詞，自然不是鐵路系統隨口說出來的，既然已經知道其獎勵背后的卑劣目的，自然就知道了其選用這個詞的時候是怎樣的心領神會：“這是怎樣的一個詞啊。感謝倉頡先生，造出了這樣兩個字，太貼切了！”這個目的的存在，實在讓他們想不到還有哪個詞比“獎勵”更能真切地體現他們的處境，以及急于擺脫這種不利處境的迫切心情。

楊萬里的詩范文第3篇

關鍵詞：工商管理專業；人才培養模式；監控體系；實踐基地

中圖分類號：G642 文獻標志碼：A 文章編號：1002-2589（2016）03-0192-02

隨著我國高等教育規模不斷擴大，高校學生毛入學率的不斷提高，生源質量也不同于精英教育階段，高等教育已經進入了大眾化教育階段，給高校發展帶來機遇的同時，提出了更嚴峻的挑戰。《國家中長期教育改革和發展規劃綱要（2010-2020年）》（以下簡稱《綱要》）[1]中明確指出：“提高質量是教育改革發展的核心任務，樹立以提高質量為核心的教育發展觀，注重教育內涵發展，鼓勵學校辦出特色、辦出水平，出名師，育英才。”因此，在實際教學過程中，如何實現分類分層教學，如何提高人才培養質量，形成具有本校特色的人才培養模式，是擺在工商管理專業教師面前的一項艱巨任務。

一、工商管理專業人才培養模式的現狀

（一）實行彈性學分制

這種人才培養模式主要是針對課程設置而進行的改革，學生可以在八年時間里修完專業要求的所有課程而畢業[2]。這種模式在一定程度上緩解了過去課程設置的弊端，增強了學生選課的自主性，學生可以根據自己的實際情況和興趣愛好自主選擇課程。但是，有很多學生為了盡量早畢業，用大學三年的時間把大學四年要修的課程都修完，這就造成了學生一周之內需要上大量的課程，影響了學生對于知識的消化和吸收，同時也影響了學生的全面發展。

（二）分類分層人才培養模式

這種人才培養模式主要針對學生對專業知識的學習而言[3]。學生進入專業課學習階段后，學校可以根據學生的自身特點和興趣，實行分類、分層教學，設置不同的專業課程模塊供學生來選修，也可以把專業方向細化為不同的模塊，比如人力資源管理、物流管理、生產與運作管理、創業管理等，學生可以根據自己的喜好、優勢等情況選擇相關模塊的課程，通過學習，使學生在某一方面具有較深厚的造詣。

（三）“3+1”人才培養模式

這種人才培養模式是近年來比較盛行的模式[4]，即要求學生在大學前三年主要從事專業學習，在大學的最后一年從事社會實踐。這種模式的優點就是能夠使學生有足夠的時間從事社會實踐，但是學生要用三年時間將四年的課程學完，一定程度上增加了學生的學習壓力，而且如果學校沒有校外實踐基地，讓學生自己從事社會實踐，就必然會導致學生盲目地到企業打工掙錢，從而與專業培養目標相悖。

（四）“3.5+0.5”人才培養模式

這種人才培養模式也受很多高校所推崇，即要求學生用三年半的時間學完大學所有課程，最后半年通過社會實踐來撰寫畢業論文。這種人才培養模式既能夠讓學生有足夠的時間從事專業知識的學習，又能夠抽出一定的時間讓學生從事社會實踐。但是如果專業課程設置不合理也必然無法實現專業人才培養目標。

（五）“1+2.5+0.5”人才培養模式

這種人才培養模式是在高校專業大類招生情況下實施的，即按照大類專業來招收學生，在大學一年級不分具體專業，到大學二年級學生根據自己的興趣可以任意選擇大類專業下的具體專業進行學習。這種培養模式的優勢就是能夠讓學生通過一年的學習，再根據對自身、專業、社會人才需求的認識，重新進行專業的選擇和定位。

二、工商管理專業人才培養模式存在的問題

北方工業大學是一所北京市教委主管的地方院校，目前工商管理專業本科有3個班，專升本有2個班，每一屆學生有170人左右。目前，工商管理專業的人才培養模式已逐步從“3.5+0.5”模式向“1+2.5+0.5”模式轉化，但從人才培養的過程和培養目標來看，仍然存在一些問題。

（一）培養目標與人才培養過程脫節

學校工商管理專業培養學生的目標是把學生培養成既懂技術又懂管理的復合應用型人才。但是，在人才培養過程中，不僅學生的管理理論素養沒能得到提高，學生的實踐能力也沒有得到鍛煉。學生在選擇就業單位時，往往感到無所適從，達不到用人單位的高標準、嚴要求，培養過程質量與培養目標嚴重脫節。

（二）個別專業課程設置不合理

一般情況下，在大學學習階段，通識課、專業基礎課應當盡量安排大學一、二年級，專業必修課安排在大學三、四年級。學校工商管理專業的課程設置中，部分課程設置不合理，有個別專業課程安排在了大學一、二年級，而且還呈現過度娛樂化，這勢必會讓學生與其他課程進行對比，從降低了對其他課程學習的積極性。

（三）校外實踐基地不健全

學校校內的實踐教學內容已經非常豐富，但對于校外實踐基地的建設一直落后于同類院校，無法達到教學大綱規定的實踐教學目標。因此建立校外實踐基地對于工商管理專業學生的培養來講顯得非常重要，也是提高學生實踐能力的有力保障。

三、工商管理專業人才培養模式的完善

（一）完善人才培養監控體系

通過對人才培養方案的完善修訂，建立健全各類人才培養監測點的考核標準，明確培養計劃中專業評價各監測點的內容、目標以及人才培養質量考核的標準和方法，具體體現學校的專業建設特色和專業評價體系的有效實施[5]。在人才培養過程中，應當建立配套的監測點和監控體系，完善工商管理專業的人才培養監控體系，如圖1所示。

學校和學院可以通過制訂人才培養質量標準、實施方案和相關規章制度，建立起高效優質的人才培養保障、服務和支撐體系，確保人才培養質量監控有效實施，保障人才培養方案的順利實施。

（二）突出特色，注重質量，提高人才培養質量

工商管理專業是學校的老牌專業，從學校到學院都非常重視學科建設和人才培養模式的改革。為了提高學生的實踐能力，實踐教學的比重在逐步增大，但是校外實習基地的建設還一直不夠健全。因此，加強校外實習基地建設對于突出人才培養特色，提高人才培養質量有著重要的意義。在現有教學實習的模式下，可以逐步與一些大型國有企業建立長期合作關系，定期派學生到企業去實習、鍛煉，使學生真正把所學理論知識與企業實踐結合起來，從實踐中發現問題，再結合所學知識解決問題，實現理論與實踐的有機結合，從而更加突出北方工業大學工商管理專業的人才培養特色。

（三）構建人才培養模塊，優化人才培養方案

結合學校工商管理專業特色和社會需求，構建人才培養特色模塊。在加強理論教學（通識課+基礎課+專業課）的同時，注重實踐教學的質量和效果，聯系幾家大型企業作為學生校外實踐基地，在實踐中構建“1+2+1”人才培養模塊或“1+2+0.5+0.5”人才培養模塊，加強課堂教學、實踐教學、企業實踐的密切聯系。

1.“1+2+1”人才培養模塊

在學校工商管理專業大類招生背景下，構建“1+2+1”人才培養模塊勢在必行。在這種人才培養模塊中，校外實踐基地的建設顯得尤為重要。學生在大學期間除了學習專業知識，要用最后一年的時間去企業實習和鍛煉，在實踐中檢驗所學專業知識的掌握程度，發現問題，及時補救。

2.“1+2+0.5+0.5”人才培養模塊

這種人才培養模塊也是符合學校工商管理專業發展和社會需求的。學生在大學期間除了學歷理論知識外，在最后一年中用半年時間在企業實習，再用半年的時間結合企業實踐撰寫畢業論文，從實現理論與實踐的有機結合。

3.優化人才培養方案

結合人才培養模塊，優化人才培養方案，是實現工商管理專業人才培養目標的重要途徑。制訂新的人才培養方案應著重從課程設置、專業實習、課程設計、校外實踐等幾個方面來進行改進。首先課程設置應從學生實際和學校的人才培養目標出發，科學、合理地制訂學生在三個階段的課程，在第一階段（一年級）應著重通識課程的學習，把數學、外語、專業基礎課的學習作為重中之重；在第二階段（二、三年級）著重專業基礎課和專業必修課程的學習，在第三階段（四年級）重點放在學生的實踐方面，努力提高學生的實踐能力。其次，專業實習可放在每年的寒假和暑假，學校和與企業達成合作意向，組織學生進入企業調研和實踐。課程設計課程的設置根據課程特點和專業培養目標而制訂。校外實踐基地是專業實習和畢業實踐的重要保障，學校應當把建設校外實踐基地作為人才培養的重中之重。

四、結語

工商管理是一門實踐性非常強的學科，該專業的人才培養目標應該定位于著重培養學生的實踐能力、協調溝通能力和創新能力。當前，學校工商管理專業正面臨著前所未有的挑戰和發展機遇，為實現人才培養目標，應堅持以市場需求為導向，以學生為中心，抓住重點，突出特色，重點培養學生的學習能力、應變能力、適應能力、人際溝通、協調和創新能力，提高學生發現、分析和解決實際問題的能力。

參考文獻：

[1]顧明遠.國家中長期教育改革和發展規劃綱要（2010-2020年）[M].北京：北京師范大學出版社，2010.

[2]程春.論高校彈性學分體質的創新與發展[J].知識經濟，2013（24）：153.

[3]梁川.基于動機激發理論的分層教學模式的實踐研究[J].遼寧高職學報，2015，17（8）：40-42.

楊萬里的詩范文第4篇

團聚前夕慈父走失，央視主持人心碎了

2012年8月12日，唐山一家酒樓，一場熱鬧非凡的婚禮正在舉行。賓朋們都對新郎孫昊霖的勵志故事贊嘆不已。曾經，他只是唐山歌舞團一名普通員工。2006年，他進京發展，數年積累后一鳴驚人：2012年勇奪央視《星光大道》月冠軍，隨后進入央視軍事?農業頻道，擔任《美麗中國鄉村行》欄目主持人。女友于樂游是一家家具公司職員，兩人相戀4年，感情甚篤。這一天也是父親孫國軒最激動的一天。一對新人在臺上笑靨如花，孫國軒在臺下也合不攏嘴。婚后第三天，孫吳霖和于樂游要返回北京。他想讓父親和自己一起去北京生活，父親卻搖了搖頭：“現在還不是時候。等你在北京買了房，有了孩子，爸就過去幫你們帶孩子。”

2012年11月9日，孫昊霖剛走出央視演播大廳就接到大姐的電話：‘快，爸突發腦溢血，在醫院搶救！’孫昊霖連夜趕回唐山，了解到父親發病的經過：天氣轉冷，父親準備買煤在家燒暖氣過冬。本來―個電話煤廠就能將蜂窩煤送到家，但父親為了省120塊錢運費，硬是自己踩著三輪車往返5趟往家運煤。父親運最后一趟時，突發腦梗塞。唐山人民醫院里，父親躺在病床上，陷入昏迷……孫昊霖握著父親干枯而又冰冷的手，淚流滿面。

父親一生坎坷，因家里窮38歲才結婚，妻子曾有過一段婚姻，帶著兩個兒子兩個女兒嫁過來。父母婚后第一年生下了孫昊霖。在他童年的記憶里，雖然家境貧困，但一家人過得平靜和睦。孫昊霖10歲那年，母親因心肌梗塞去世。其后，父親欲再婚，但少不更事的孫吳霖堅決阻止，直到他20歲考入唐山歌舞團，父親才重組家庭，臉上也多了笑容。不料2009年繼母意外溺水身亡，父親十分悲傷，每天早晨7點就去公園拉二胡，一邊拉一邊落淚。

第二天，父親終于蘇醒。老人睜開眼，第一句話竟是：“你和樂游工作那么忙，我給你們添麻煩了。”孫昊霖失聲痛哭：“爸，等你病好了跟我們去北京吧！我再也不把你一個人扔下了！”

接下來短暫的幾天，在孫昊霖的記憶中盈滿為數不多的溫馨。他教父親唱歌，給他講述這些年的“北漂”經歷。

幾天后的一個早晨，孫吳霖從醫院食堂買回早餐，孫國軒突然愣愣地望著他，帶著幾分怯意問：“你是？”孫吳霖傻了：“爸，你怎么了？”然而父親忽然掙扎著起身，要往外走：“這是什么地方？我怎么在這里？”孫昊霖趕緊按床頭呼叫鈴。主治大夫趕來一問，孫國軒又叫出了孫昊霖的名字，昨晚聊天內容也記得一清二楚。孫昊霖一頭霧水。大夫解釋：“這種情況屬典型的小腦萎縮，是腦梗塞后遺癥造成的。”孫昊霖心如刀絞，他決定盡快將父親帶到北京醫治。11月20日，孫國軒病情得到控制，孫昊霖為父親辦理出院手續，將他托付給大姐照顧后，火速返回北京，著手將租住的單間換成一套兩居室。11月28日下午，孫昊霖打掃好新房間，正準備動身回唐山，大姐忽然打來電話：“爸上午去超市買東西，到現在還沒回來！”

孫昊霖瘋狂地打電話給唐山所有的親戚……

從央視辭職尋父，有一種孝心叫義無反顧

當晚，孫吳霖的二姐和兩個哥哥也相繼趕到。他們召集30多位親友，明確分工：兄妹5人分別帶領一個小組，以家為中心在周邊20公里范圍內搜尋。孫昊霖連夜印了500份尋人啟事，在社區、公園、街道、火車站、汽車站張貼。不知不覺天就亮了，孫昊霖無力地靠在路邊的欄桿上，他第一次感到人生像幻覺―樣。他不停地鼓勵自己，也許下一刻，父親就會在晨曦中出現，笑吟吟地看著他……來不及合眼，孫昊霖又逐一找到父親的老同事詢問，向在公園經常聽父親拉二胡的老人打聽。一位掃馬路的大姐告訴他，11月28日上午，她看見孫國軒騎車往519國道方向去。孫昊霖一個激靈，立即帶領幾位親友沿國道兩側的餐廳、旅店、超市尋找。每一份希望都激動人心，又都在極度盼望中逐一被現實磨滅。3天后，哥哥姐姐帶領的搜索小組也失望返回唐山。幾天幾夜沒吃飯的孫吳霖有氣無力地回到家中。

報警后，孫昊霖又在唐山電視臺尋人啟事。等待數日，絕望將他緊緊包裹，無法喘息。在眾人的勸說下，12月4日，他黯然返回北京。白天，孫昊霖要打起精神主持節目；晚上，他靠在床上暗自落淚。父親的走失幾乎摧毀了孫昊霖的生活。

2013年2月9日黎明，孫昊霖又一次被噩夢驚醒。世界安靜得像夢一樣，窗外正飄著雪花。孫昊霖慢慢從床上坐起來，孫昊霖披衣而起，和著淚水寫了一首歌《爸爸你去哪兒了》：“老爸你去哪啦/你可知道兒子在牽掛/老爸你去哪啦/兒永遠等你回家/十歲那年媽媽走了/留下我和我的老爸老爸雖沒啥文化腳含辛茹苦將我養大……”歌詞飽蘸淚水，一個念頭也油然而生：放下一切，去尋找父親1

2013年春節后，孫昊霖向大姐宣布：“我準備辭職找咱爸。”哥哥姐姐堅決反對：“你從北漂歌手到今天容易嗎？爸不見了，我們也還得讓生活越來越好啊！”然而無論他們怎么勸，也無法動搖孫昊霖的決心。正當孫吳霖猶豫著以何種方式將計劃告訴妻子時，于樂游已從大姐那里得知消息。2013年3月6日，孫昊霖下班回到家，于樂游問：“大姐說的都是真的嗎？”孫昊霖不吱聲，于樂游一下子火了：“你還想要寶寶，到時拿什么養孩子？你不僅要對你爸負責，也得對我負責啊！”孫昊霖輕輕抱住妻子：“我們來日方長……”掙扎了兩日，孫昊霖還是瞞著妻子向領導遞交了辭呈。半個月后，孫昊霖的辭職報告批下來了。他不敢止訴于樂游，回家后輕輕地壓在床頭柜上。于樂游發現后徹底憤怒了，當即提出離婚，并搬進了單身宿舍。看著衣柜空了一邊，孫吳霖才從恍惚中回過神來。

第二天一早，孫昊霖煲了一罐烏雞湯送到妻子公司。此時，于樂游的怨氣已消弭許多。孫吳霖難過地拉住她的手：“我媽走后，很多人給爸介紹對象，家里只要一來陌生女人，我就用彈弓夾石子彈人家……上高中時，我愛好音樂，做夢都渴望擁有一把吉他。爸爸撫養5個孩子，經濟非常拮據。整整一個冬天，他下班后靠在雪地里拉磚頭，掙了100元錢給我買了吉他，但他手上被凍裂的血口子又深又長，夾得住硬幣……”孫昊霖數度哽咽落淚。于樂游的眼睛也紅了，沒有再掙脫他的手。

2013年5月，孫昊霖花3萬元去二手車市場淘回一輛二手金杯車。他將后排座椅拆掉，加裝一個折疊沙發，打開就是一張小雙人床；一個塑料箱用來放衣服、被褥及生活用品。他還在車身兩側，用藍色不干膠張貼“尋父大篷車”5個搶眼大字。5月16日，夫婦倆駕駛“導父大篷車”從北京出發，踏上悲壯的尋父征程。

“尋父大篷車”走天涯，20萬里孝心找回父親

夫妻倆設計的路線為：河北、山東、河南、山西。他們尋找的第一站，是與唐山交界的廊坊。到達廊坊，孫昊霖與于樂游分頭行動：他向公安機關和社會救助站備案、求助，調取走失流浪人員的視頻資料；于樂游去車站、市場、公園張貼尋人啟事……夜里，兩人相擁擠在車里的小沙發床上。

但讓孫昊霖怎么也沒有想到的是，幾天后，于樂游突然感覺身體不適，到附近的社區診所檢查，竟然發現懷孕了！近1個月來，小兩口餓了啃冷面包，渴了喝礦泉水，孫昊霖想到就羞愧難當。他攬住妻子單薄的雙肩，眼里一下子蒙了一層淚。于樂游反而勸他：“繼續找吧，你一個人在外面，我也不放心。”

尋父繼續。廊坊沒有發現父親的蹤跡，孫昊霖夫婦轉而趕往與唐山毗鄰的滄州。7月4日，孫昊霖夫婦在滄州泊頭鎮派出所調閱2012年12月26日的監控錄像。當一個模糊的影像出現時，孫昊霖失聲叫了出來。那不是父親嗎！上午9點至11點的視頻中，孫昊霖隱約看到父親沿著泊頭中學往東走。夫妻倆跑出派出所，又開始瘋狂尋找。遺憾的是，整整半個月，兩人尋遍了滄州的每個角落，也沒發現父親的蹤影。

滄州與山東交界，也許父親已經離開河北達到山東？孫昊霖決定臨時改變路線，放棄河北境內的秦皇島、衡水等地，直奔山東。

兩天后，“尋父大篷車”行駛至山東德州。一位賣西瓜的大爺告訴孫昊霖，濱德高速公路立交橋下有個拾荒老人，已在那里住兩個月了。孫吳霖以最快的速度找到拾荒老人，可根本不是父親。孫昊霖默默將200元錢放在老人身邊，悵然離去……

顛沛流離中，4個月過去了。夫妻倆出門時帶的3萬元花得精光。未來的路，要尋父、要養子，孫昊霖不得不沿途在酒吧和夜總會唱歌。

11月上旬，夫婦倆來到山東泰安。傍晚在翻越蓮花山時，車子爆胎環在了半山腰。孫昊霖撥打救援電話，因說不出準確位置，夫婦倆在車里困了大半宿。轉眼大半年，尋父之旅每天都在進行卻又毫無進展，經濟更加窘迫。于樂游和孫昊霖商量：“昊霖，過幾個月孩子就出生了，你不能完全將事業丟在―邊。”孫昊霖十分慚愧。2013年12月，孫昊霖聽說北京有個演出能掙5000多元錢，他就去參加。演出完畢，又第一時間趕來與妻子會合……就在如此艱難的環境中，2014年1月，孫昊霖參加央視大型娛樂節目《黃金100秒》比賽，竟一舉奪得冠軍。

2014年2月28日，夫婦倆到達河南新鄉。孫昊霖下車去集貿市場張貼尋父啟事，于樂游在駕駛室里等丈夫。中午時分，于樂游腹部忽然襲來一陣劇痛，寶寶要降生了！她掙扎著給孫昊霖打了個電話。孫昊霖趕緊駕車趕往縣醫院。顛簸中，于樂游感到撕心裂肺的劇痛，接著身子一空。孫吳霖回頭一看，不禁兩腿發軟，兒子在車上出生了！1個星期后，孫昊霖將妻兒送回北京，請岳母幫忙照顧。6月，他依依不舍地告別妻兒，再次返回河南尋父。

2015年3月，孫昊霖開著他的“大篷車”，趕赴山西長治武鄉縣。他接到當地一個養蜂人的電話，稱這里有位老人很像他父親。3月17日，到達武鄉縣后，孫昊霖第―時間與養蜂人聯系。他被帶到一戶平常的農舍前。像往常每一次心懷希望一樣，他緊張地看著門被敲開，希望那一瞬間洞開奇跡。

一位老人出現了。孫昊霖忽然身體發直，失聲痛哭：“爸――”終于見到了朝思暮想的父親！然而父親愣愣地看著孫昊霖，已經不認識他。一陣哭訴之后，孫昊霖被請進家門。原來，收留孫國軒的是一位名叫王玉庭的孤寡老人，與孫國軒同齡。第二天，孫昊霖開著他的“大篷車”，將父親接回北京。孫昊霖的哥哥姐姐聞訊趕來，一家人喜極而泣。

楊萬里的詩范文第5篇

關鍵詞：甲烷古菌； Hungate除氧系統； 富集； 滾管分離； 純培養

中圖分類號：Q939文獻標識碼：A 文章編號：1006-3315（2014）04-170-003

厭氧微生物的分離是黔南民族師范學院微生物課程開放性實驗項目之一。目前國內高校多數實驗室對嚴格厭氧菌分離純化主要采用焦性沒食子酸法、厭養罐法、厭養培養箱法等[1]。焦性沒食子酸法進行厭養菌分離培養,由于其方法簡單，操作容易,在大專院校微生物實驗教學中仍廣泛使用,但操作過程厭氧條件不易控制，特別是對嚴格厭氧的甲烷古菌分離效果差。厭養罐法能夠為厭氧菌生長提供嚴格厭氧的環境，但不能為整個分離純化操作過程提供厭氧環境，使用受到限制。厭養培養箱法雖然能為厭氧菌分離培養提供嚴格厭氧環境，需要特制設備,在厭氧箱中操作也不方便，由于價格昂貴，因而其應用受到一定限制。為此，為了改進厭氧細菌的分離純化方法，結合對厭氧消化器中甲烷古菌的分離與純化開放性實驗，借助Hungate除氧系統進行稀釋滾管分離，收到了很好的效果，現將有關技術介紹如下。

一、材料用具

1.接種物

取自黔南民族師范學院微生物實驗室厭氧發酵缸（厭氧消化器）底部的沉積物。

2.儀器用具

2.1Hungate除氧系統。Hungate除氧系統由高純氫氣、高純氮氣，銅柱，加熱套，不銹鋼分支管，橡皮膠管，注射器及9號針頭等組成。銅柱結構直徑30～50mm、長300～500mm的石英玻璃管，兩端加工成漏斗狀，便于連接膠管，玻璃管中裝入碎銅絲（長10～20mm，直徑0.5mm），壓緊，銅絲下面墊上玻璃纖維以防止碎銅絲散落，上端留出50mm左右的空間。銅柱外纏繞加熱帶，銅柱頂端用膠管與具有分支的不銹鋼通氣總管連接。不銹鋼總管下的各分支管用橡皮膠管連接，橡皮膠管的另一端連接1mL塑料質注射器，注射器再與9號針頭連接（圖1）。

圖1Hungate厭氧操作系統示意圖

2.2其它器具。高壓滅菌鍋，恒溫水浴鍋，恒溫培養箱，熒光顯微鏡，厭氧管（16×160mm），厭氧瓶（100mL），光波爐，3000 mL三角瓶，各種規格的注射器（1mL、2mL、5mL）等。

二、方法

1.獲取無氧N2、H2、CO2氣體

甲烷菌是嚴格厭氧微生物，都能利用H2和CO2合成CH4，一般分離甲烷菌都用H2和CO2作為營養。其分離過程需要人工保持一個無氧環境進行操作和供其生長繁殖。用于分離嚴格厭氧微生物使用的氣體雖然是高純氣體（99.999%），但仍然含有微量的O2，利用Hungate銅柱除氧系統可除掉這些微量的O2，提供和保持無氧環境。

2.銅柱除氧與還原

銅柱除氧原理：實驗使用的高純氣體（N2、H2、CO2）中含有微量的O2，當氣體經過銅柱時，這些氣體中的微量O2與Cu反應生成CuO（O2＋CuCuO），從而流出銅柱的氣體則為無O2氣體。

銅柱還原：銅柱使用后，里邊的Cu被氧化為CuO不能繼續與O2發生化合反應，失去除氧能力。此時，關掉其它氣體，通入H2，同時使銅柱升溫（達350℃），當H2通過高溫銅柱時，銅柱內CuO與H2反應（CuO＋H2Cu＋H2O）生成單質Cu，CuO在加熱條件下（350℃）被H2還原為Cu，銅柱恢復除氧能力可反復使用。

操作步驟：打開Hungate銅柱除氧系統通氣橡皮管的通氣開關（止水夾），開啟H2鋼瓶，H2氣流通過銅柱，從銅柱里流出的H2用橡皮管引出室外。此時接通電熱套電源，銅柱升溫，溫度達到350℃左右，20～30min后，銅柱內的碎銅絲被H2還原，由黃黑色變為純銅錚亮色，當銅柱里面的水蒸氣被排出完全后，關閉H2鋼瓶，銅柱還原結束。

3.獲取無氧N2、H2和CO2氣體

無氧N2用于厭氧菌分離操作和培養過程中驅趕空氣，保證局部無氧環境。在銅柱還原結束后，立即打開N2鋼瓶，氣流大小控制以針頭對準操作者手背5cm距離明顯感覺到氣流為宜，并隨時注意控制氣流的大小。此時銅柱內的碎銅絲處于還原狀態的單質銅，當通入高純N2（99.999%）時，其中所含的極微量氧與單質銅反應，氧被固定下來（形成CuO），流出銅柱的則是無氧N2。利用無氧N2氣流驅趕厭氧管、血清瓶等培養容器和培養基中的空氣，以及挑菌時保證無氧環境。使用完畢后，先關緊N2鋼瓶，接著用止水夾封閉所有橡皮管。無氧H2、CO2的獲取方法操作步驟相同。

2.制備無氧培養基

2.1培養基配方（詳見表1）

表1培養基配方表[2]

注：微量元素溶液配制時先溶解氨三乙酸，NaOH調pH于6.5左右。依次溶解其它化合物，最后調pH于7.0。

3.制備方法

按照配方稱取藥品置于事先放有適量蒸餾水的三角瓶中溶解后，加入1mL的1‰刃天青液（W/V），0.4g的鹽酸半胱氨酸，用NaOH調節pH值，加足需要水量，用記號筆在三角瓶外壁標上記號，加入一定量的蒸餾水作蒸發量后，置于光波爐加熱煮沸10min后，通入無氧N2（驅趕空氣，保持培養基為無氧狀態）煮沸至培養基顏色變白后再煮10min左右進行分裝。用9號針頭連接的橡皮管，將無氧N2引入待裝培養基的厭氧管和厭氧瓶（16×160mm厭氧管、100mL厭氧瓶）洗管、瓶（用無氧N2換出瓶中空氣，使容器中無氧分子存在），用培養基分液器進行分裝，厭氧管裝4.5mL，厭氧瓶裝45mL，待裝好培養基后取出N2管塞上橡膠塞，旋緊蓋子。轉好培養基的厭氧試管用專用布袋裝好與厭氧瓶一起置121℃，0.1MPa滅菌20min待用。（厭氧瓶內的培養基使用前加入無菌無氧1%Na2S溶液0.1mL和10%NaHCO30.1mL，厭氧管內培養基使用前加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL）。

4.甲烷菌富集

用水樣取樣器取沼氣底泥5克于上述裝有45mL培養基的厭氧瓶中，利用Hungate厭氧系統，按H2/CO2體積比為40/10的比例分別加入H280mL、CO220mL，置30℃恒溫培養30天，用化學吸收法[3]檢測厭氧瓶是否有甲烷氣體產生，在甲烷菌生長對數增長中期，從產甲烷氣體的富集瓶中取樣進行滾管分離。

5.滾管分離和純化培養

5.1滾管分離培養。對檢測有甲烷菌存在的富集處理，進行第1次滾管分離。在分離培養基中補加瓊脂粉（20g/L），分裝于厭氧試管（16 mm×160mm，4.5mL培養基/管），滅菌。滅菌后置55℃水浴中保持液態，每支厭氧管中分別加入1%Na2S溶液0.02mL和10%NaHCO30.02mL。用1mL無菌無氧注射器取富集的樣品液0.5mL，作10-1～10-9梯度稀釋，重復3次，每支試管上下倒2～3次（注意不要產生氣泡），使樣品與培養基充分混勻并立即將稀釋管置于裝有4℃以下冰水的磁盤中迅速滾管，使培養基與樣品均勻光滑無氣泡凝固于管壁上。

將滾管分離樣品的厭氧管置于試管架上，按H2/CO2體積比為40/10的比例分別加入H240mL、CO210mL，置30℃恒溫培養30天，在管壁的培養基上有明顯的菌落出現，用化學吸收法檢測是否有甲烷氣體產生。對有甲烷氣體產生的管子，置于熒光顯微鏡下觀察菌落，對有熒光反應的菌落用記號筆畫圈作出記號，待進一步分離培養。

5.2甲烷菌純化。純化過程是多次挑取單菌落、稀釋滾管培養的過程。截取細玻璃管（內徑0.5cm、外徑0.8cm，長15cm），兩端塞上脫脂棉，在酒精燈的火焰上加熱并拉成毛細管，高溫滅菌并烘干。在無氧條件下挑菌：將有熒光反應菌落的管子置于鐵架臺上固定，打開管口，用無氧N2吹入管中，使管內保持無氧狀態。取毛細管一端與橡膠管連接（橡膠管一端用夾子封住，含在口中），另一端（2mm左右處）在酒精燈火焰上加熱并使之彎成約90℃，用它的彎頭接觸到有熒光記號的菌落，輕吸一口氣，使菌落進入毛細管，移出毛細管并快速放入有4.5mL培養基的無氧管子中，迅速塞上膠塞的同時折斷毛細管并旋上外蓋。按H2/CO2體積比為40/10的比例分別加入H240mL、CO210mL，置30℃恒溫培養30天，在管壁的培養基上有明顯的菌落出現，用化學吸收法檢測是否有甲烷氣體產生。

通過單菌落分離獲取的菌液經培養后底部有沉淀出現，用吸收法檢測管中有無甲烷氣體產生。對有甲烷氣體的菌管，用上述方法再進行2次滾管分離，則可獲得甲烷菌的純培養。挑取純培養菌落進行液體培養30d后，置4℃條件下進行保藏，同時進行鑒定。

6.甲烷菌鑒定

6.1菌落熒光反應檢測。利用產甲烷古菌在特定波長（420nm）激發下能產生特有的藍綠熒光，對分離到的樣品管進行菌落熒光反應檢測，有熒光反應的樣品管證明其有甲烷菌存在。

6.2產甲烷氣體檢測。利用甲烷菌能產生甲烷氣體的特性，將有熒光反應的樣品管用氣相色譜儀或化學吸收法進行產甲烷氣體檢測，有甲烷氣體產生的樣品管，再一次證明樣品中有甲烷菌存在。

6.3產甲烷菌純度檢測。用1mL注射器抽取有熒光反應的樣品液置熒光顯微鏡下觀察，菌體有熒光產生，物氣體雜菌，則為甲烷菌純菌，并將置常溫冰箱4℃保藏，待進一步研究或應用。

三、結果與小結

1.結果

1.1利用稀釋滾管分離法從厭氧消化器中分離獲得99支甲烷古菌純培養，經產甲烷氣體和熒光反應鑒定證明是甲烷菌（圖2）。

甲烷桿菌屬甲烷短桿菌屬甲烷球菌屬甲烷微球菌屬

Methanobacterium Methanobrevibacter Methanococcus Methanobacterium

（1000×） （1000×）（1000×）（1000×）

圖2采用稀釋滾管分離純化法得到的甲烷菌圖片

1.2甲烷菌分離純化技術流程

經上述試驗，歸納建立甲烷菌分離純化技術，其流程如下：

第一次滾管分離

第二次滾管分離

第三次滾管分離

1.3小結

采用Hungate厭氧操作系統清除氧氣徹底，操作過程能及時發現和控制無氧環境。培養基中加入對氧氣敏感的刃天青指示劑，能及時觀察操作過程的無氧狀態，使整個操作過程和培養都在無氧狀態，滿足嚴格厭氧的要求。建立的稀釋滾管分離法操作簡便、利用熒光顯微鏡觀察，菌落易于辨認，易挑取，操作過程不易污染，分離效率高等優點。只要滿足厭氧微生物的營養需求，樣品中的厭氧微生物都能分離出來。

基金項目：黔教高發[2012]426號；黔南民族師范學院微生物學重點學科[2011.6]；黔南民族師范學院教學質量工程項目院教發[2011]5號。

參考文獻：

[1]龐德公,楊紅建.產甲烷菌的分離純化培養及其培養基對于菌株的選擇作用[J]中國畜牧獸醫,2010，37(6)：32―35