表觀遺傳學(xué)研究方法

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表觀遺傳學(xué)研究方法范文第1篇

表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，基因及其表達(dá)的遺傳性改變不僅僅是指基因突變或基因多樣性等DNA序列的變化。已知的三種可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)改變主要是：基因組DNA的甲基化，組蛋白修飾，非編碼RNA的調(diào)節(jié)（如microRNA）。上述機(jī)制均涉及外在因素在蛋白質(zhì)編碼序列不變的情況下仍可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[4]。表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)機(jī)制存在個(gè)體及組織差異性，并且可以隨年齡增長(zhǎng)、環(huán)境及疾病狀態(tài)的改變而變化。表觀基因組在基因組表達(dá)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，個(gè)體間基因表達(dá)的不同造成藥物不同的反應(yīng)性，這可能是通過(guò)表觀遺傳學(xué)改變進(jìn)行調(diào)節(jié)的。因此，目前認(rèn)為表觀遺傳學(xué)改變可以幫助解釋基因突變?cè)谒幬锓磻?yīng)中的作用，繼而在臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮作用，這一迅速崛起的新學(xué)科稱為表觀遺傳藥理學(xué)。個(gè)體間藥物的反應(yīng)性不同，該學(xué)科不僅研究表觀遺傳因子在這一過(guò)程中的作用，而且旨在開(kāi)發(fā)新的藥物靶點(diǎn)[5]。筆者認(rèn)為表觀遺傳藥理學(xué)與遺傳藥理學(xué)將共同在藥理學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)中發(fā)揮重要作用。目前為止，表觀遺傳藥理學(xué)的大多數(shù)研究集中于腫瘤學(xué)領(lǐng)域，例如，研究細(xì)胞色素p450在個(gè)體間表達(dá)的差異。幸運(yùn)的是，表觀遺傳學(xué)修飾的作用已被應(yīng)用于解釋其他復(fù)雜并且多源的現(xiàn)象，應(yīng)用的范圍越來(lái)越廣。在這里，筆者總結(jié)了表觀遺傳修飾在心衰及心血管疾病治療方面最新的研究。

1表觀遺傳修飾與心力衰竭

1.1組蛋白的修飾

龐大的真核生物基因組在高度保守的組蛋白的作用下得到了緊密的壓縮。在核小體中，基因組DNA圍繞核心組蛋白（核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4各兩組）折疊、壓縮，形成了染色體的基本單位。基因組DNA與染色體蛋白的相互作用有助于轉(zhuǎn)錄因子向靶基因片段聚集，從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性[6]。通過(guò)這種機(jī)制，核小體利用其核心組蛋白的共價(jià)修飾傳遞表觀遺傳學(xué)信息。這些修飾包括組蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化及SUMO化修飾。核心組蛋白的氨基末端從染色質(zhì)絲上伸出來(lái)，與DNA或其他組蛋白、蛋白質(zhì)等相互作用。該末端上的賴氨酸、精氨酸殘基是組蛋白修飾的主要靶點(diǎn)。多數(shù)研究旨在了解賴氨酸乙酰化、甲基化的作用。事實(shí)證明，賴氨酸的乙酰化作用主要與染色質(zhì)親和力及轉(zhuǎn)錄相關(guān)，而賴氨酸的甲基化作用取決于何種殘基被修飾。有趣的是，正如Mano所總結(jié)的那樣，組蛋白乙酰化的調(diào)控與心肌肥厚相關(guān)。去氧腎上腺素可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，這一過(guò)程需要乙酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的組蛋白乙酰化。與此結(jié)果相一致的研究是針對(duì)Ⅱ類組蛋白去乙酰基酶（HDACs）5、9的研究，其通過(guò)抑制心肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（MEF2）的活性進(jìn)一步阻礙致肥厚基因（pro-hypertrophicgenes）的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗肥厚的作用。與此相反，Ⅰ類HDACs具有相當(dāng)強(qiáng)的致肥厚作用，其通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇三磷酸酰胺磷酸酯酶的表達(dá)發(fā)揮作用。這意味著，HDACs在多水平上控制肌肉細(xì)胞的體積。

1.2DNA甲基化

在真核生物中，DNA甲基化是通過(guò)將甲基團(tuán)轉(zhuǎn)移到核苷酸胞嘧啶環(huán)的5''''位碳原子上完成的。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，DNA甲基化主要發(fā)生在基因的5''''-CG-3''''序列，也指的是CpG雙核苷酸；人體內(nèi)，大約70%的CpGs發(fā)生甲基化。另一方面，未甲基化的CpGs存在于許多基因的5''''端調(diào)控區(qū)域，以CpG島的形式出現(xiàn)。與其他DNA區(qū)域相比，CpG雙核苷酸在CpG島出現(xiàn)的概率較高。人體內(nèi)CpG島甲基化的不同是表觀遺傳學(xué)改變的組成部分。DNA胞嘧啶甲基化有助于局部轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的結(jié)合，其與組蛋白修飾共同在局部及整個(gè)基因組中影響染色體的結(jié)構(gòu)。因此，DNA甲基化的一個(gè)重要作用是調(diào)控基因的表達(dá)。在這方面，CpG島超甲基化可以使基因沉默，而低甲基化使基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄。有人認(rèn)為，甲基化是一種穩(wěn)定遺傳的修飾，但同時(shí)它也受到環(huán)境因素的影響。如小鼠野鼠色基因位點(diǎn)，可以受到其上游轉(zhuǎn)座子甲基化狀態(tài)的影響。從遺傳角度來(lái)講，完全相同的親代其野鼠色基因不同的甲基化狀態(tài)可使得后代出現(xiàn)不同的毛色[7]。最近，Kao等[8]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在心衰特定的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮作用。他們發(fā)現(xiàn)促炎癥基因TNF-α可下調(diào)肌漿網(wǎng)Ca2+-ATPase（SERCA2A）的表達(dá)，這是通過(guò)增強(qiáng)SERCA2A啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)完成的。Movassagh等[9]發(fā)現(xiàn)，在心肌病及人類心肌組織形成時(shí)甲基化的狀態(tài)是不同的。而且，他們鑒別出三個(gè)基因位點(diǎn)（IECAM1、PECAM1、AMOTL2），在不同的心臟樣本中，位點(diǎn)甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)的調(diào)控密切相關(guān)。

1.3MicroRNAs

MicroRNAs是短的雙鏈RNA分子，來(lái)源于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中較大的RNA前體，其可以在基因轉(zhuǎn)錄后對(duì)基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。miRNAs可以對(duì)30%～50%的蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行調(diào)控，這一過(guò)程主要是通過(guò)與mRNA3''''端未轉(zhuǎn)錄區(qū)域的堿基對(duì)進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，繼而干擾轉(zhuǎn)錄，靶mRNAs可降解或暫時(shí)沉默[10]。miRNAs調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)是非常復(fù)雜的，多種miR-NAs可以作用于同一基因，不同基因也可受到同一種miR-NAs的調(diào)節(jié)。miRNAs的表達(dá)具有組織、疾病特異性。近年來(lái)，多種病理狀態(tài)下的miRNA分子標(biāo)記已被檢測(cè)出來(lái)，如各種類型的腫瘤以及多種心血管疾病[11]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNAs與基本的細(xì)胞功能密切相關(guān)。目前，miRNAs與心衰的關(guān)系已得到明確，在過(guò)去的幾年中，該領(lǐng)域的報(bào)道層出不窮。對(duì)心血管疾病的研究主要集中于兩種心臟組織特異表達(dá)的miRNA家族（miRNA-1/miR-NA-133、miRNA-208）。多項(xiàng)研究顯示，miRNA在健康、高血壓以及不同病因所導(dǎo)致的人、小鼠、大鼠衰竭的心臟中均有表達(dá)，Divakaran等[12]發(fā)現(xiàn)心臟特異性的miRNA-208不僅可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞肥大、纖維化同時(shí)可在應(yīng)激、甲退時(shí)調(diào)節(jié)β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）的表達(dá)。這種miRNA由α-MHC基因的內(nèi)含子編碼。該基因編碼α-MHC及一種主要的心肌收縮蛋白，使心臟變大，在應(yīng)激以及激素信號(hào)作用下通過(guò)miR-NA-208及其作用位點(diǎn)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。再者，定向刪除心肌特異性的miRNA，miRNA-1-2，揭示了它們?cè)谛呐K中的多種功能，包括調(diào)節(jié)心臟的形態(tài)發(fā)生、電信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞周期的調(diào)控。Thum等[13]發(fā)現(xiàn)，受損心肌中miRNA標(biāo)記與胚胎心中miRNA表達(dá)的類型極為相似，這說(shuō)明受損心肌中重啟了胚胎基因的表達(dá)程序。Thum等[13]另一個(gè)發(fā)現(xiàn)是miRNA-21可以調(diào)控ERK-MAP激酶途徑，這種調(diào)控在心臟成纖維細(xì)胞中尤為明顯，心肌細(xì)胞中卻沒(méi)有這種表現(xiàn)，這可以影響到心臟的結(jié)構(gòu)及功能。在成纖維細(xì)胞中，miRNA-21水平的增高可通過(guò)抑制特定基因來(lái)激活ERK激酶，經(jīng)由這種機(jī)制，miRNA-21調(diào)節(jié)了間質(zhì)纖維化、心肌肥厚。上述研究揭示了在心臟成纖維細(xì)胞中，基因調(diào)節(jié)的另一種方式是在miRNA介導(dǎo)的旁分泌水平上進(jìn)行的。miRNA在心臟肥厚反應(yīng)中的意義得到了進(jìn)一步的研究，miRNA成為基因調(diào)控的主要調(diào)節(jié)因子。到目前為止，miRNA已被證實(shí)不僅可以影響心肌，還可以影響心臟電信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)節(jié)血管再生[14]。

2表觀遺傳篩選方法

表觀基因組學(xué)示意圖不是固定的，它因細(xì)胞類型、時(shí)間的不同而不同，并且可在生理學(xué)、病理學(xué)、藥物作用情況下發(fā)生改變。因此，作為人類基因組計(jì)劃的后續(xù)工程，表觀基因組測(cè)序是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。雖然判斷基因組序列的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)是比較容易完成的，描繪整個(gè)表觀基因組需要對(duì)數(shù)十個(gè)基因組進(jìn)行測(cè)序，覆蓋一個(gè)有機(jī)體在生命不同階段的所有細(xì)胞類型。亞硫酸氫鹽測(cè)序法是標(biāo)測(cè)DNA甲基化類型最為準(zhǔn)確的方法。基因組DNA與亞硫酸氫鈉相作用，導(dǎo)致未甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。為觀察特定基因的甲基化狀態(tài)，用特異性引物對(duì)目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，隨后對(duì)產(chǎn)物測(cè)序。在序列中，甲基化的胞嘧啶被標(biāo)記為Cs，未甲基化的胞嘧啶為T(mén)s。近來(lái)出現(xiàn)了多個(gè)對(duì)甲基化進(jìn)行定位的全基因組研究方法，它們都是以甲基化和未甲基化的CpGs對(duì)限制性內(nèi)切酶的敏感性不同為基本原理的。限制長(zhǎng)度的基因組掃描利用兩種酶雙酶切DNA，一種是頻繁切割的甲基化非敏感性限制內(nèi)切酶，另一種是罕見(jiàn)的甲基化敏感性的酶如Not1，這種酶只有在非甲基化狀態(tài)時(shí)才可以酶切所識(shí)別的位點(diǎn)。還有一種完全不同全基因組研究方法是利用DNA芯片技術(shù)，它可以一次性標(biāo)測(cè)成千上萬(wàn)的CpG島的甲基化狀態(tài)。這種方法可以用來(lái)識(shí)別CpG島，相對(duì)于正常的調(diào)控過(guò)程來(lái)說(shuō)，CpG島在腫瘤組織中發(fā)生甲基化。亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的替代方法是ChIP-seq方法（一種與測(cè)序相結(jié)合的染色質(zhì)免疫沉淀方法）。通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)使得目的蛋白與DNA發(fā)生交聯(lián)，然后對(duì)DN段進(jìn)行基因組測(cè)序。這一方法可以幫助識(shí)別任何DNA相關(guān)蛋白的DNA結(jié)合位點(diǎn)。該技術(shù)還可以提供組蛋白修飾的信息，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化修飾。對(duì)ChIP技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)得到的DCS方法，是將ChIP與消減式PCR進(jìn)行偶聯(lián)。該方法旨在避免基因組片段與芯片雜交后產(chǎn)生非特異性信號(hào)。以同樣的方式可以檢測(cè)人體病理狀態(tài)下miRNA的作用，大多數(shù)研究是利用高通量的方法分析臨床病例中總miRNA的表達(dá)情況。高通量技術(shù)是以miRNA基因芯片和real-timeRCP為代表的。盡管分子間的差別給這些技術(shù)帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)，但miRNA芯片最大的優(yōu)點(diǎn)是具有很高的特異性，而缺陷是其敏感性較低。

3藥物可以改變表觀遺傳狀態(tài)

表觀遺傳學(xué)改變正常及疾病狀態(tài)下的表型，這可能意味著充分理解和調(diào)控表觀基因組對(duì)于人類常見(jiàn)疾病的防治具有重要意義。表觀遺傳學(xué)為我們提供了一個(gè)重要的窗口，來(lái)認(rèn)識(shí)環(huán)境與基因在疾病發(fā)生過(guò)程中的相互作用以如何調(diào)節(jié)這些作用達(dá)到改善人類健康的目的。miRNA派生的反義寡核苷酸是單鏈RNA分子，對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾可能是針對(duì)致病miRNA新的方法。但是這種方法困難重重，miRNA屬于密切相關(guān)的家族，且很難合成針對(duì)每一種miRNA的反義寡核苷酸。再者，一個(gè)單獨(dú)的miRNA可針對(duì)多種基因發(fā)揮作用，它們之中可能含有對(duì)心肌有益的分子。在這方面，寡核苷酸的化學(xué)修飾可能會(huì)特異性破壞miRNA與單個(gè)mRNA的作用，這可能是疾病治療良好的備選方案。每一種miRNA可以以不同的強(qiáng)度針對(duì)成百上千的基因發(fā)揮作用，所以在體內(nèi)miRNA修飾的最終作用尚不明了。最終，將miRNA拮抗劑應(yīng)用于臨床領(lǐng)域?qū)⒚媾R很多困難，這與我們?cè)诨蛑委煼矫嫠龅降臉O為相似，如導(dǎo)入方式、載體、特異性以及毒性等問(wèn)題[15]。至少在理論上，針對(duì)特異性miRNA的方法將來(lái)可能是治療缺血性心臟病、心肌肥厚、心衰、血管再生、離子通道病的有效手段，可控制心衰的發(fā)展。另一種方法可能是將靶DNA甲基化。一些影響基因組DNA甲基化的化學(xué)合成劑已經(jīng)應(yīng)用于臨床，例如5-氮胞嘧啶、抑制甲基轉(zhuǎn)移酶的氮胞嘧啶可以使DN段脫氨基。其它藥物是通過(guò)阻礙甲基化酶的活性而發(fā)揮抑制甲基化作用。更多信息可參照Gomez等[16]的文章。除了要開(kāi)發(fā)可以調(diào)節(jié)DNA甲基化的藥物外，還需要設(shè)計(jì)可以影響組蛋白修飾的藥物。在抗腫瘤藥物的發(fā)展過(guò)程中，組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑占據(jù)著重要地位，它可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)與腫瘤相關(guān)的異常表觀遺傳改變，繼而發(fā)揮作用。已有證據(jù)表明，在心肌肥厚時(shí)，HDAC抑制劑可修復(fù)基因表達(dá)程序。Gallo等證明體外試驗(yàn)中，曲古霉素A、丁酸鈉可延緩心臟肥厚。

4表觀遺傳學(xué)和環(huán)境

眾所周知，環(huán)境因素如毒素、飲食可以影響DNA甲基化和染色質(zhì)修飾，并且可遺傳給下一代。雌激素、抗雄激素類物質(zhì)可改變DNA甲基化狀態(tài)降低男性的生育能力，這也是可遺傳的。該假說(shuō)認(rèn)為，環(huán)境因素可以改變表觀遺傳學(xué)標(biāo)記和基因表達(dá)形式，這可能在人類疾病研究中具有重要意義。常見(jiàn)疾病大多受到基因和環(huán)境因素的雙重影響，環(huán)境可誘導(dǎo)表觀遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而將基因和環(huán)境因素聯(lián)系起來(lái)[17]。年齡在基因與環(huán)境相互作用中發(fā)揮重要作用。常見(jiàn)病的發(fā)病率隨著年齡的增加不斷增高，這與在人的一生中表觀遺傳學(xué)改變不斷累積有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于年輕者而言，年長(zhǎng)的同卵雙胞胎體內(nèi)總DNA甲基化及組蛋白H3K9乙酰化的水平較高，但該研究沒(méi)有檢測(cè)同一個(gè)體中表觀遺傳學(xué)改變隨時(shí)間變化的情況。

表觀遺傳學(xué)研究方法范文第2篇

【關(guān)鍵詞】 急性髓細(xì)胞白血病； 表觀遺傳學(xué)； 靶向治療

急性髓細(xì)胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一組異質(zhì)性疾病，以造血干細(xì)胞克隆紊亂為特征，是成年人急性白血病中最常見(jiàn)的類型。近20年來(lái)，人們對(duì)AML的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后的研究有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，患者的完全緩解率也有了明顯的提高，但仍有2/3成年AML患者未能達(dá)到治愈，復(fù)發(fā)、難治及老年AML仍是目前臨床治療的難題。為此，臨床工作者和科研人員不斷探索新途徑，積極尋求AML治療新方法。

近年來(lái)，表觀遺傳學(xué)的研究逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。隨著研究的深入，人們對(duì)AML的發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)，隨之而來(lái)的靶向治療也給患者重新帶來(lái)希望。該研究主要包括三個(gè)方面的內(nèi)容：DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼microRNA。研究表明，表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制參與調(diào)節(jié)許多重要的生理過(guò)程。在血液腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)化中，表觀遺傳學(xué)異常與遺傳學(xué)異常具有同樣重要的作用。表觀遺傳基因的修飾對(duì)于基因的差e表達(dá)有著至關(guān)重要的作用，它決定著細(xì)胞的類型及細(xì)胞從良性到惡性的轉(zhuǎn)變。尤為重要的一點(diǎn)，這種修飾是可遺傳的、動(dòng)態(tài)的、可逆的，并且不影響下游的DNA序列。表觀遺傳的修飾基因，如DNMT3A，TET2，IDH1和IDH2，ASXL1和MLL1上的頻發(fā)突變，影響了造血細(xì)胞的自我更新和/或分化能力，促進(jìn)髓系細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)白血病的形成[1]。表觀基因組在AML的發(fā)生中有重要的靶標(biāo)性作用，它具有內(nèi)在可塑性，通過(guò)特異性的酶、轉(zhuǎn)錄因子、與表觀遺傳機(jī)制相關(guān)的其他蛋白重新編碼對(duì)表觀遺傳基因的修飾，為治療提供了新的可能。

本文將描述表觀遺傳基因的失調(diào)是如何在AML中發(fā)揮作用的，同時(shí)強(qiáng)調(diào)目前和未來(lái)的治療手段在發(fā)現(xiàn)新靶標(biāo)上的多種嘗試。此外，還將涉及AML中個(gè)體化的靶向治療，包括術(shù)語(yǔ)的定義，適應(yīng)證的相關(guān)描述以及臨床實(shí)施的具體措施。

1 表觀遺傳學(xué)的針對(duì)性治療

1.1 DNMT3A突變及DNMT抑制劑 DNA甲基化是表觀遺傳調(diào)控的重要組成部分，通常與轉(zhuǎn)錄沉默有關(guān)。在急性白血病中，已被確定多種腫瘤抑制基因的過(guò)甲基化與轉(zhuǎn)錄抑制通過(guò)增殖、分化和生存過(guò)程的失調(diào)導(dǎo)致白血病的發(fā)生[2]。來(lái)自MDS的DNA甲基化譜研究數(shù)據(jù)顯示，抑癌基因的異常甲基化可能是驅(qū)動(dòng)MDS進(jìn)展為AML的主要機(jī)制[3]。胞嘧啶甲基化是指C5位的胞嘧啶殘基被DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）催化，并生成C5甲基胞嘧啶（5-MC）的過(guò)程。基因組DNA甲基化是由DNMT3通過(guò)半甲基化的模板（從頭甲基化）建立的，并由DNMT1全甲基化模式（維持甲基化）予以保持。這些過(guò)程使得不同的可遺傳的DNA甲基化模式可以用來(lái)區(qū)分AML亞型、預(yù)測(cè)預(yù)后，并有潛力作為生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)患者對(duì)治療的反應(yīng)[4]。AML要么普遍低甲基化，要么過(guò)甲基化，這提示表觀遺傳途徑的過(guò)度和不足可能對(duì)白血病的發(fā)生都很重要[5]。數(shù)據(jù)表明，在白血病干細(xì)胞中，DNMT1可維持其DNA甲基化模式，并參與其自我更新的過(guò)程[6]。研究表明，DNMT3A在造血干細(xì)胞自我更新和分化過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。重要的是，DNMT3A的功能缺失性突變發(fā)生在30%的細(xì)胞遺傳學(xué)正常的AML中，可能與臨床預(yù)后較差有關(guān)，但AML的這些突變對(duì)于DNA胞嘧啶甲基化和轉(zhuǎn)錄的影響尚不清楚，且DNMT3A的單獨(dú)缺失并不足以導(dǎo)致白血病形成[7]。大多數(shù)的突變涉及882位的精氨酸，在體外導(dǎo)致甲基轉(zhuǎn)移酶活性的降低[8]。到目前為止，尚無(wú)特異性針對(duì)DNMT3A的靶向治療。本節(jié)討論的“表觀遺傳修飾的靶向治療”指的是針對(duì)DNMT抑制劑的去甲基化治療。

美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的2種DNMT抑制劑為：阿扎胞苷及其脫氧衍生物地西他濱。這兩種藥物均用于MDS的治療，現(xiàn)在依據(jù)一些臨床試驗(yàn)的結(jié)果，也普遍應(yīng)用于AML的治療。

在一項(xiàng)多中心Ⅱ期研究中，有227位初治AML患者接受了地西他濱治療。每個(gè)療程中靜脈滴注地西他濱持續(xù)72 h，用量為135 mg/m2，間隔6周重復(fù)用藥，共4個(gè)療程[9]。該研究表明，總體有效率為26%，中位生存期為5.5個(gè)月，1年存活率為28%。在另一項(xiàng)多中心Ⅱ期臨床試驗(yàn)中，給予55位60歲以上的AML患者靜滴地西他濱治療，每日用量為20 mg/m2，連續(xù)5 d給藥，每4周為一療程。結(jié)果，該試驗(yàn)中AML的完全緩解率為24%，中位生存時(shí)期為7.7個(gè)月。

在一項(xiàng)針對(duì)高危MDS（包括骨髓中原始細(xì)胞比例為20%～30%、根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)列為AML）的臨床試驗(yàn)中，給予患者阿扎胞苷治療：每日用量為75 mg/m2，連續(xù)7 d皮下注射用藥，28 d為一個(gè)療程。與對(duì)照組（接受傳統(tǒng)治療方案）相比，阿扎胞苷組有明顯的生存獲益。而對(duì)于一些次要的評(píng)價(jià)指標(biāo)而言，比如輸血需求、靜脈抗生素的使用和住院天數(shù)等，阿扎胞苷組有明顯優(yōu)勢(shì)。與之類似的是，在法國(guó)的一項(xiàng)臨床研究中，149名初治老年AML患者接受了相同劑量和療程的氮雜胞苷治療，總體有效率為33%，完全緩解率為23%，總體生存期為9.4個(gè)月[10]。對(duì)于接受了大劑量誘導(dǎo)化療和異基因造血干細(xì)胞移植的AML患者，使用阿扎胞苷維持治療可能會(huì)減少或延遲白血病的復(fù)發(fā)。

1.2 IDH1/2突變及IDH1/2抑制劑 DNA甲基化與同型二聚體酶IDH1/2催化的檸檬酸代謝有關(guān)，二聚體酶可催化異檸檬酸氧化脫羧成α-酮戊二酸（α-KG）。研究發(fā)現(xiàn)，有10%～30%正常核型的AML患者發(fā)生了IDH1/2功能突變，引起酶功能異常，導(dǎo)致2-羥基戊二酸（2-HG）的產(chǎn)生和積累。由于TET2和包含jumonji-c結(jié)構(gòu)域家族的組蛋白賴氨酸去甲基化酶均依賴于α-KG，當(dāng)機(jī)體發(fā)生IDH1/2突變，并積累2-HG，可導(dǎo)致DNA和組蛋白甲基化的增加[11]。IDH1/2突變對(duì)預(yù)后的影響研究得到了自相矛盾的結(jié)果，可能是因?yàn)橥蛔兾恢玫牟町惡停ɑ颍┌殡S其他基因的突變。例如，一項(xiàng)關(guān)于AML的隨機(jī)臨床試驗(yàn)表明，IDH2的第140位的精氨酸殘基發(fā)生突變與良好的預(yù)后相關(guān)。不但如此，同時(shí)伴有NPM1和IDH1或IDH2突變的細(xì)胞遺傳學(xué)正常的AML患者也有良好的受益，3年總生存率（OS）可高達(dá)89%。然而，IDH1/2和TET2突變是相互排斥的，但具有這兩種不同的突變的AML患者具有相似的甲基化過(guò)程。

目前，一項(xiàng)早期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，旨在研究IDH1/2抑制劑對(duì)發(fā)生了IDH1/2突變的AML患者的影響。這是一種針對(duì)IDH1/2突變酶的小分子靶向抑制劑，可減少2-HG的生成，誘導(dǎo)H3K9me3的脫甲基作用，并能增強(qiáng)相關(guān)分化基因的表達(dá)[12]。

1.3 MLL基因突變及DOT1L蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑 MLL基因位于染色體11q23，編碼H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶（HMT），該酶參與組蛋白的重構(gòu)，影響HOX基因和Wnt信號(hào)通路[13]。有5%～7%的初發(fā)AML病例發(fā)生MLL重排，與不良預(yù)后相關(guān)[14]。MLL區(qū)域是染色體易位和重排的高發(fā)區(qū)，能產(chǎn)生多種融合蛋白，其中一些有致癌性。研究顯示，MLL融合蛋白和DOT1L之g的作用導(dǎo)致了白血病的發(fā)生[15]。

已有研究表明，DOT1L HMT的酶活性誘導(dǎo)了存在MLL基因重排的AML的形成。DOT1L抑制劑可減少H3K79的甲基化和MLL融合基因的表達(dá)。目前，具有高度選擇性的DOT1L抑制劑的研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，而選擇性抑制HMT EZH2的強(qiáng)效抑制劑也正在研究中。

1.4 組蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制劑 單獨(dú)使用HDAC抑制劑治療AML，其臨床作用并不令人滿意。因而，能否與DNMT抑制劑聯(lián)合使用增強(qiáng)療效，則備受期待。目前，諸多相關(guān)的臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展當(dāng)中，而且對(duì)多種HDAC抑制劑，包括丙戊酸、mocetinostat、帕比司他、伏立諾他等，與阿扎胞苷或地西他濱聯(lián)合使用的療效進(jìn)行了評(píng)價(jià)，但結(jié)果并不如人意。在一項(xiàng)二期臨床試驗(yàn)中，恩替諾特聯(lián)合阿扎胞苷治療AML并未提高療效[16]。需要注意的是，與早期的體外試驗(yàn)采用序貫用藥不同，此項(xiàng)試驗(yàn)中這兩種藥物是同時(shí)應(yīng)用的。恩替諾特是一種強(qiáng)效的細(xì)胞周期抑制劑，可能會(huì)抑制阿扎胞苷的整合，導(dǎo)致脫甲基作用減弱。

1.5 賴氨酸乙酰化抑制劑 具有布羅莫結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可識(shí)別組蛋白末端的賴氨酸殘基，這種相互作用可被小分子抑制劑所抑制。當(dāng)前，已開(kāi)始對(duì)數(shù)種BET抑制劑進(jìn)行臨床試驗(yàn)。研究表明，BET抑制劑可抑制白血病干細(xì)胞和祖細(xì)胞增殖，并且可阻斷MLL介導(dǎo)的白血病轉(zhuǎn)化[17]。

1.6 賴氨酸去甲基化酶抑制劑 研究結(jié)果顯示，KDM1A/LSD1在體外可有效抑制AML細(xì)胞系和原代白血病細(xì)胞。在聯(lián)合使用HDAC抑制劑和全反式維甲酸時(shí)，這種抑制作用更顯著。研究表明，MLL白血病受其影響最大，AML的其他亞型和其他髓系腫瘤也對(duì)之敏感[18]。

2 表觀遺傳學(xué)發(fā)展在AML靶向治療方面的挑戰(zhàn)

2.1 靶向治療的治療靶點(diǎn) AML在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有一系列的異常表現(xiàn)，就疾病本身而言，有許多方面的異常可以進(jìn)行針對(duì)性的治療，包括表觀遺傳途徑的調(diào)節(jié)、基因突變、細(xì)胞表型、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、白血病干細(xì)胞和骨髓微環(huán)境等。最近有關(guān)AML克隆構(gòu)型的研究表明，AML克隆異質(zhì)性始終伴隨著疾病的進(jìn)展及復(fù)發(fā)[19]。因而，AML的治療靶點(diǎn)是不斷變化著的，在疾病的不同時(shí)期需用不同的藥物進(jìn)行治療。有關(guān)初發(fā)AML克隆構(gòu)型的研究顯示，在基因?qū)用娼缍ǖ陌籽喛寺『桶籽「杉?xì)胞之間具有明顯的功能異質(zhì)性[20]。目前的挑戰(zhàn)是明確和清除所有的克隆，而非以往那樣狹隘地認(rèn)為，靶向治療的關(guān)鍵就是應(yīng)用某種方法，通過(guò)單向靶點(diǎn)來(lái)消除優(yōu)勢(shì)克隆。

2.2 靶向治療的對(duì)象 如何選擇靶向治療的對(duì)象是一個(gè)比較重要的問(wèn)題。根據(jù)不同的分類方法，AML患者可劃分為不同的亞群，但這樣的分類方法均有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足之處。

AML患者也可以根據(jù)預(yù)后進(jìn)行分類。在過(guò)去，對(duì)新藥的早期試驗(yàn)通常在復(fù)發(fā)和難治病例中進(jìn)行，顯而易見(jiàn)，這是一種很令人困惑的試驗(yàn)?zāi)Ｊ健Ｓ捎趶?fù)發(fā)或難治AML病例與初發(fā)病例在生物學(xué)上和臨床上是不同的，因而對(duì)初發(fā)病例作新藥研究十分重要。可以根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)初診患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并預(yù)先判斷其治療效果的優(yōu)劣。例如，一項(xiàng)研究表明，在不同的甲基化區(qū)域，有高水平甲基化的7個(gè)基因其低表達(dá)具有更好的臨床結(jié)果[21]。目前認(rèn)為，在臨床研究中，靶向治療的對(duì)象應(yīng)該是那些預(yù)后可能不良的初發(fā)AML病例。

2.3 靶向治療的時(shí)機(jī) 臨床上通常將AML治療分為誘導(dǎo)、鞏固和緩解后治療。臨床研究表明，把針對(duì)表觀遺傳學(xué)調(diào)控的靶向藥物與其他藥物聯(lián)合使用，結(jié)果比單一用藥效果更好。因此，已考慮將試驗(yàn)新藥添加到主流的誘導(dǎo)方案當(dāng)中來(lái)。多年來(lái)有關(guān)AML治療的臨床實(shí)踐表明，尚無(wú)哪一種化療方案更優(yōu)于阿糖胞苷聯(lián)合蒽環(huán)類藥物的“7+3”經(jīng)典方案的，所以應(yīng)把該方案作為主要的誘導(dǎo)方案，新藥可以添加于此或者作為單藥評(píng)估其療效。這樣，納入臨床試驗(yàn)的初治患者將會(huì)接受其一進(jìn)行治療。

各種證據(jù)表明，誘導(dǎo)后殘留的白血病細(xì)胞與治療前的腫瘤細(xì)胞在生物學(xué)上是有區(qū)別的。因此，臨床上重復(fù)應(yīng)用同一治療方案并不合理。研究表明，表觀遺傳學(xué)靶向治療在AML完全緩解后或移植后，或可控制白血病克隆的演變。目前，多數(shù)靶向治療藥物是非細(xì)胞毒性的，對(duì)低負(fù)荷白血病而言，治療成功的可能性更大。當(dāng)然，還需要更多的AML患者參與到臨床試驗(yàn)中來(lái)，進(jìn)行新型藥物的有效性驗(yàn)證。

2.4 靶向治療的有效性評(píng)價(jià) 表觀遺傳學(xué)靶向治療一般需要長(zhǎng)達(dá)幾周甚至幾月的時(shí)間方顯成效。此外，基于形態(tài)學(xué)和免疫表型的分析方法并不能有效評(píng)價(jià)靶向治療的療效。因而，可以憑借DNA甲基化特征、基因表達(dá)譜、高光譜測(cè)定法以及其他技術(shù)手段來(lái)做生物學(xué)標(biāo)志的鑒定，通過(guò)生物學(xué)標(biāo)志能充分預(yù)測(cè)療效，并提高疾病監(jiān)控能力。然而，在當(dāng)前臨床實(shí)踐中，尚未能常規(guī)使用此類表觀遺傳學(xué)的生物學(xué)標(biāo)志。

3 展望

隨著對(duì)AML表觀遺傳修飾基因突變的認(rèn)識(shí)的深入，人們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)在AML生物學(xué)發(fā)生中起著復(fù)雜而重要的作用。AML的表觀遺傳學(xué)靶向治療策略已經(jīng)改變了臨床應(yīng)用，AML患者的個(gè)體化靶向治療將成為現(xiàn)實(shí)。然而，現(xiàn)實(shí)中還面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中最大的挑戰(zhàn)就是AML生物學(xué)和患者本身的高度異質(zhì)性。只有通過(guò)創(chuàng)新性的臨床試驗(yàn)、可靠的科學(xué)研究和醫(yī)患的共同參與等努力，才可能真正實(shí)現(xiàn)AML患者的個(gè)體化治療。

⒖嘉南

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表觀遺傳學(xué)研究方法范文第3篇

不受歡迎的禮物之一：心臟病

由馬薩諸塞州大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授奧利弗?蘭杜主導(dǎo)完成的這項(xiàng)研究，是表觀遺傳學(xué)的又一新成果。表觀遺傳學(xué)又稱為實(shí)驗(yàn)遺傳學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)或基因外調(diào)節(jié)系統(tǒng)，是遺傳學(xué)中的一個(gè)嶄新分支。表觀遺傳學(xué)是在不改變基因序列的前提下，基因功能可逆的、可遺傳的變化是如何表達(dá)的。這些變化包括DNA的甲基化修飾、組蛋白的各種修飾等。

該研究以兩組雄鼠為對(duì)象，其中一組剛斷奶就開(kāi)始喂低蛋白食物，直至這些老鼠性發(fā)育成熟；另一組正常喂養(yǎng)的小鼠作為對(duì)照組。之后對(duì)這些雄鼠的下一代進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：在肝臟內(nèi)與脂質(zhì)和膽固醇的生物合成有關(guān)的基因表達(dá)增強(qiáng)，與膽固醇脂（抑制膽固醇在肝臟內(nèi)的生物合成）有關(guān)的基因表達(dá)減弱。盡管小鼠的基因組序列并未發(fā)生實(shí)質(zhì)性改變，但其新陳代謝功能已受到嚴(yán)重影響，罹患心臟病的幾率大增。

這里發(fā)揮關(guān)鍵作用的是DNA甲基化。DNA甲基化指的是在DNA堿基上加入甲基基團(tuán)的化學(xué)修飾現(xiàn)象，這種變化雖然不如基因突變那樣“深入骨髓”，卻能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而控制基因表達(dá)。

研究人員在下一代小鼠DNA胞嘧啶（DNA的4種堿基之一）上觀察到了甲基化程度的適度改變（約20%）。這些相對(duì)顯著的DNA甲基化程度的改變是不良飲食長(zhǎng)期作用的直接結(jié)果。因此，父母遺傳給我們的不僅是基因，父母“告訴”我們事情的方式還有許多。

不受歡迎的禮物之二：糖尿病

澳大利亞新南威爾士大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授瑪格麗特?莫里斯等人的研究表明，雄性小鼠長(zhǎng)期食用高脂肪食物，會(huì)使其雌性后代出現(xiàn)血糖代謝障礙，增加患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，但這種效應(yīng)對(duì)雄性后代并不明顯。

研究人員讓一組雄鼠攝入高脂肪的食物，而對(duì)照組的雄鼠則用正常的食物喂養(yǎng)。結(jié)果用高脂食物喂養(yǎng)的老鼠出現(xiàn)超重現(xiàn)象并表現(xiàn)出2型糖尿病的兩個(gè)主要癥狀：血糖代謝障礙以及胰島素抵抗的問(wèn)題。令人吃驚的是，研究人員繼續(xù)對(duì)肥胖老鼠的雌性后代進(jìn)行檢查時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們也出現(xiàn)了胰島素和血糖調(diào)節(jié)障礙的問(wèn)題。此外，健康的雄鼠其雌性后代也是健康的。

人體的血糖濃度由胰臟的胰島β細(xì)胞團(tuán)分泌的胰島素控制。這些細(xì)胞成團(tuán)形成一個(gè)個(gè)的“島”。研究人員注意到，和對(duì)照組的雌鼠相比，父親肥胖的雌鼠發(fā)生了胰島萎縮。肥胖雄鼠的雌性后代身上有600個(gè)以上的胰島出現(xiàn)了基因表達(dá)的改變，但由于基因序列本身并無(wú)變化，研究人員認(rèn)為，DNA甲基化再次充當(dāng)了重要角色。

研究人員發(fā)現(xiàn)最大的基因表達(dá)改變發(fā)生在一個(gè)名為Il13ra2的基因上，這種基因可以調(diào)節(jié)不同的胰腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)和入侵，其基因的表達(dá)可以通過(guò)DNA甲基化改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組后代Il13ra2基因的甲基化水平是8.9±2.2%，約為控制組的25%（33.6±4.0%）。這種基因甲基化可能是實(shí)驗(yàn)組小鼠后代出現(xiàn)血糖代謝障礙的罪魁禍?zhǔn)住?/p>

基因并非一切

如果在人身上也有同樣的現(xiàn)象，就為心血管疾病多發(fā)與日漸增加的肥胖人口找到了一個(gè)新的解釋。這些研究也讓妻子更理直氣壯地告訴丈夫：“為了你自己，也為了孩子，請(qǐng)控制飲食。”

這兩項(xiàng)成果給人類對(duì)基因的認(rèn)識(shí)帶來(lái)了同樣深刻的改變。以往的報(bào)道中，基因似乎無(wú)所不能：基因是萬(wàn)病之源，人的生理特征如長(zhǎng)相是由基因決定的，一個(gè)人的個(gè)性、將來(lái)也與基因扯上了關(guān)系。但這些報(bào)道有相當(dāng)?shù)目浯蟪煞帧Ｖ锌圃涸菏織钣窳家粋€(gè)題為“從肥皂泡到生命過(guò)程――關(guān)于基因后生物學(xué)的點(diǎn)滴思考”的演講中曾指出，在基因之外還有很多因素，包括物理的、化學(xué)的因素等，影響著生物學(xué)功能的表達(dá)。

表觀遺傳學(xué)研究方法范文第4篇

【摘要】

目的RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）啟動(dòng)子區(qū)超甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄失活在卵巢癌中頻見(jiàn)，可作為卵巢癌診治過(guò)程中有意義的分子生物學(xué)指標(biāo)，RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白2A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）與RASSF1A同源，其基因異常甲基化在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究探討上皮性卵巢癌組織RASSF2A甲基化水平，并分析其臨床意義及高甲基化與mRNA表達(dá)情況的相關(guān)性。方法選擇2013－10－01－2014－12－31聊城市人民醫(yī)院手術(shù)治療的50例上皮性卵巢癌、27例交界性上皮性卵巢腫瘤和20例良性上皮性卵巢腫瘤患者，應(yīng)用甲基化特異性PCR（MSP）檢測(cè)卵巢腫瘤組織中RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，采用RT－PCR檢測(cè)其mRNA表達(dá)水平。采用5－氮雜2′－脫氧胞苷（5－aza－dC）對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3、3AO進(jìn)行去甲基化干預(yù)實(shí)驗(yàn)，并檢測(cè)藥物作用前后RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化及其mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果RASSF2A基因mRNA在良性上皮性卵巢腫瘤中的表達(dá)陽(yáng)性率為95．00％（19／20），交界性上皮性卵巢腫瘤為59．26％（16／27），上皮性卵巢癌組織為34．00％（17／50），表達(dá)強(qiáng)度依次下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2＝21．855，P＜0．001。RASSF2A基因啟動(dòng)子在良性上皮性卵巢腫瘤組織中的甲基化率為0（0／20），交界性上皮性卵巢腫瘤為22．22％（6／27），上皮性卵巢癌組織為46．00％（23／50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2＝15．474，P＜0．001。RASSF2A甲基化水平與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性。RASSF2A基因甲基化與其mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，甲基化陽(yáng)性組織的mRNA表達(dá)水平明顯低于甲基化陰性組織。5－aza－dC藥物作用后，卵巢癌細(xì)胞株中RASSF2A基因甲基化被逆轉(zhuǎn)，而其基因表達(dá)明顯升高。結(jié)論RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的基因表達(dá)沉默與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】

上皮性卵巢癌；甲基化；RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白2A基因；基因檢測(cè)

上皮性卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中惡性程度最高和預(yù)后最差的腫瘤，其病死率居?jì)D科惡性腫瘤首位［1］。大量研究已證實(shí)，RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily1Agene，RASSF1A）啟動(dòng)子區(qū)超甲基化介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄失活是卵巢癌中的頻發(fā)事件，可作為卵巢癌診治過(guò)程中有意義的分子生物學(xué)指標(biāo)［2－4］。與RASSF1A具有高度同源性的RAS相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白1A基因（RASassociateddomainfamily2Agene，RASSF2A）異常甲基化在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)RT－PCR和MSP方法檢測(cè)良性上皮性卵巢腫瘤、交界性上皮性卵巢腫瘤和上皮性卵巢癌組織及卵巢癌細(xì)胞株中RASSF2AmRNA的表達(dá)及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，分析RASSF2A啟動(dòng)子甲基化與其mRNA的表達(dá)以及卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系，探討RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1材料與方法

1．1標(biāo)本來(lái)源收集2013－10－01－2014－12－31聊城市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的上皮性卵巢癌患者50例，交界性上皮性卵巢腫瘤27例，良性上皮性卵巢腫瘤20例。所有組織標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診，所有患者術(shù)前均未接受任何放化療或激素治療。標(biāo)本采集在離體后10min內(nèi)進(jìn)行，并迅速放入液氮罐保存，后轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存。上皮性卵巢癌病例中，依據(jù)2006年FIGO分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期31例；依據(jù)2003年WHO組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，漿液性腺癌24例，黏液性腺癌16例，子宮內(nèi)膜樣癌10例；高分化10例，中分化15例，低分化25例；有淋巴轉(zhuǎn)移27例，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移23例；年齡＜50歲者19例，≥50歲者31例。

1．2細(xì)胞株卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和3AO由聊城市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1．3主要試劑Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，DNA甲基化試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，引物均由上海生工設(shè)計(jì)合成。

1．4實(shí)驗(yàn)方法

1．4．1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理在37℃、5％CO2及飽和濕度的孵育箱中靜置培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株，用含10％胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基及時(shí)換液。用終濃度為10μmol／L的5－aza－dC處理卵巢癌細(xì)胞株，常規(guī)換液，保持上述藥物濃度。于藥物連續(xù)作用72h后收集細(xì)胞。

1．4．2RT－PCR檢測(cè)參照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取組織及細(xì)胞總RNA。測(cè)得其濃度及純度符合實(shí)驗(yàn)要求后，取2μL總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所得cDNA經(jīng)半定量PCR擴(kuò)增。RASSF2A基因上游序列為5′－GCG－CCTAGAACGTGTTTTTC－3′，下游序列為5′－ACT－AGGCGTCCTCACATTGC－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為563bp。以GAPDH作為內(nèi)參基因，上游為5′－CAA－CGGATTTGGTCGTATT－3′，下游為5′－CACAGTC－TTCTGGGTGGC－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為166bp。PCR反應(yīng)條件為95℃10min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1．4．3DNA的提取及亞硫酸鹽修飾采用酚氯仿法提取組織及細(xì)胞總DNA，并對(duì)基因組DNA進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，按照甲基化特異性PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所得產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增或保持在－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．4．4甲基化特異性PCR使用2對(duì)引物檢測(cè)RASSF2A基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。甲基化引物正義鏈為5′－GTTCGTCGTCGTTTTTTAGGCG－3′，反義鏈為5′－AAAAACCAACGACCCCCGCG－3′，非甲基化引物正義鏈為5′－AGTTTGTTGTTGTTTTTTA－GGTGG－3′，反義鏈為5′－AAAAAACCAACAACCC－CCACA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均為108bp。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10min，95℃變性30s，58℃復(fù)性30s（甲基化）；54℃復(fù)性30s（非甲基化），72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。所得產(chǎn)物電泳后攝像，分析結(jié)果。

1．4．5甲基化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)若僅甲基化引物擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，為完全甲基化；若僅非甲基化引物擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，為非甲基化；若兩者均擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，為部分甲基化。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13．0分析數(shù)據(jù)。RASSF2A甲基化、mRNA表達(dá)在卵巢腫瘤組織間的差異以及基因甲基化與臨床病理特征等計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fishier確切概率法。RASSF2A甲基化及其表達(dá)之間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析法。卵巢癌細(xì)胞系中RASSF2AmRNA表達(dá)量比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05。

2結(jié)果

2．1卵巢腫瘤組織RASSF2AmRNA的表達(dá)表1和圖1所示，卵巢良性腫瘤、交界性腫瘤及卵巢癌組織中RASSF2AmRNA表達(dá)率依次降低，分別為95．00％（19／20）、59．26％（16／27）和34．00％（17／50），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2＝21．855，P＜0．001。兩兩比較結(jié)果顯示，卵巢癌組與交界性腫瘤組比較，χ2＝4．568，P＝0．033；卵巢癌組與良性腫瘤組比較，χ2＝21．280，P＜0．001；交界性腫瘤組與良性腫瘤組比較，χ2＝7．719，P＝0．005；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．2卵巢腫瘤組織RASSF2A基因甲基化水平表1和圖2所示，97例卵巢組織標(biāo)本均成功進(jìn)行了MSP實(shí)驗(yàn)。50例卵巢癌組織標(biāo)本中有13例發(fā)生了部分甲基化，10例完全甲基化，甲基化頻率為46．00％（23／50）；27例交界性卵巢腫瘤中甲基化陽(yáng)性率為22．22％（6／27），其中2例為完全甲基化。而20例良性卵巢腫瘤組織均未擴(kuò)增出甲基化陽(yáng)性條帶，甲基化頻率為0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2＝15．474，P＜0．001。

2．3RASSF2A基因甲基化與其表達(dá)的相關(guān)性表2所示，RASSF2A基因甲基化狀態(tài)與其mR－NA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。在RASSF2A基因發(fā)生甲基化的組織中，RASSF2A基因表達(dá)明顯降低，提示RASSF2A基因高甲基化可能是該基因表達(dá)沉默的原因之一。

2．4甲基化狀態(tài)與卵巢癌臨床病理特征相關(guān)性表3所示，RASSF2A甲基化程度與卵巢癌患者的年齡、病理類型、臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無(wú)明顯的相關(guān)性。

2．55－aza－dC作用結(jié)果圖3所示，卵巢癌細(xì)胞株SKOV3和3AO中均檢測(cè)到RASSF2A基因甲基化，經(jīng)去甲基化藥物5－aza－dC作用后，SKOV3細(xì)胞由完全甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)榉羌谆?AO細(xì)胞甲基化狀態(tài)被部分逆轉(zhuǎn)。SKOV3和3AO中RASSF2AmRNA表達(dá)水平較低，經(jīng)藥物干預(yù)后，SKOV3（t＝－5．258，P＝0．006）和3AO細(xì)胞株（t＝－3．060，P＝0．038）RASSF2AmRNA表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

近年來(lái)，隨著腫瘤分子生物學(xué)及表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，腫瘤抑制基因失活在癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到人們的重視。總的來(lái)說(shuō)，其機(jī)制可概括為遺傳學(xué)機(jī)制及表觀遺傳學(xué)機(jī)制，換言之，腫瘤抑制基因功能的失活既可以是不可逆的，即遺傳學(xué)機(jī)制，如基因的突變或染色體的缺失，也可以是可逆的，即表觀遺傳學(xué)機(jī)制，如基因甲基化或組蛋白修飾。與遺傳學(xué)不同，表觀遺傳學(xué)主要研究?jī)?nèi)容不涉及DNA序列的改變，且在細(xì)胞分裂過(guò)程中具有可遺傳的、可逆性的基因組修飾作用［5］。DNA甲基化是哺乳動(dòng)物基因組中最普遍的表觀遺傳學(xué)事件。相對(duì)于Knudson’s的二次打擊學(xué)說(shuō)，基因甲基化僅靠一次打擊就可導(dǎo)致基因失活，腫瘤易感性增加［6］。RASSF2是新近發(fā)現(xiàn)的RASSF家族成員之一，生物信息學(xué)分析顯示，RASSF2與其他成員一樣，也含有RAS相關(guān)域［7］。RASSF2位于人類常染色體20p13，有329個(gè)氨基酸的開(kāi)放閱讀框，11個(gè)外顯子。根據(jù)不同的啟動(dòng)子和外顯子選擇剪接，可形成RASSF2A、RASSF2B和RASSF2C3個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，其中，RASSF2A是最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本，也是唯一一個(gè)含有5′CpG島的轉(zhuǎn)錄本。RASSF2A在卵巢癌組織中發(fā)揮抑癌基因的作用，如抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等，是一個(gè)腫瘤抑制基因。本研究分析了RASSF2A基因在上皮性卵巢癌組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及其甲基化水平。RT－PC檢測(cè)結(jié)果顯示，RASSF2A基因表達(dá)水平在良性卵巢腫瘤、交界性腫瘤及卵巢癌組織中依次降低，提示RASSF2A的轉(zhuǎn)錄失活，可能參與了卵巢癌的惡性演進(jìn)過(guò)程，RASSF2A在上皮性卵巢癌中也起到抑癌基因的作用。張嫻等［8］研究結(jié)果顯示，RASSF2A基因甲基化可能參與了宮頸癌的發(fā)生，與宮頸癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，良性卵巢腫瘤組織中未發(fā)生RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)甲基化，而基因異常甲基化從交界性腫瘤到癌呈逐漸上升的趨勢(shì)，RASSF2A基因甲基化從無(wú)到有，從少到多的現(xiàn)象，說(shuō)明了RASSF2A基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化從卵巢上皮增殖階段就開(kāi)始起作用，與卵巢癌發(fā)生密切相關(guān)。多項(xiàng)研究表明，RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與基因表達(dá)沉默有關(guān)［9－11］。本研究結(jié)果表明，在發(fā)生RASSF2A甲基化的組織中，其基因表達(dá)水平明顯下降，兩者呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果提示，在卵巢癌中RASSF2A啟動(dòng)子甲基化是導(dǎo)致其低表達(dá)或者表達(dá)缺失的重要原因，這在細(xì)胞試驗(yàn)中也得到驗(yàn)證。應(yīng)用甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5－aza－dC對(duì)卵巢癌細(xì)胞株進(jìn)行去甲基化處理后，卵巢癌細(xì)胞株的基因啟動(dòng)子甲基化被逆轉(zhuǎn)，而其mR－NA的表達(dá)水平明顯升高，從而進(jìn)一步證實(shí)了RASSF2A啟動(dòng)子CpG島的異常甲基化在調(diào)節(jié)RASSF2A基因的表達(dá)中發(fā)揮重要作用。研究顯示，RASSF2A基因甲基化程度與宮頸癌、胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)［8，12］，而與胰腺癌和結(jié)直腸癌［9，13］患者臨床病理特征無(wú)關(guān)。另有研究表明，基因啟動(dòng)子甲基化水平與癌癥患者年齡密切相關(guān)［14］。在子宮內(nèi)膜癌的研究中顯示，＞45歲的患者更容易發(fā)生RASSF2A甲基化（P＝0．041）［15］。在結(jié)腸癌和口腔鱗癌中也發(fā)現(xiàn)，RASSF2A基因甲基化程度與年齡相關(guān)［13，16］。在生物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，伴隨著時(shí)間的進(jìn)程，DNA甲基化異常會(huì)不斷呈現(xiàn)，由此認(rèn)為，表觀遺傳學(xué)疾病是一種與年齡相關(guān)性疾病。這在某種程度上解釋了為什么腫瘤多發(fā)生在老年人。檢測(cè)DNA甲基化程度可作為細(xì)胞衰老的標(biāo)志之一。本研究結(jié)果顯示，RASSF2A基因甲基化水平與卵巢癌患者的臨床病理參數(shù)之間無(wú)明顯的相關(guān)性，是上皮性卵巢癌中的早期頻發(fā)事件，隨著患者年齡的增加，RASSF2A基因甲基化有增高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能上皮性卵巢癌中RASSF2A基因甲基化不是年齡相關(guān)的表觀遺傳學(xué)改變。

綜上所述，RASSF2A啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化是卵巢癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的頻發(fā)事件，是導(dǎo)致卵巢癌中RASSF2A低表達(dá)或表達(dá)缺失的重要原因，其參與了卵巢癌的發(fā)病過(guò)程，并在卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。監(jiān)測(cè)RASSF2A基因啟動(dòng)子CpG島甲基化水平可作為表觀遺傳學(xué)的分子靶標(biāo)，指導(dǎo)卵巢癌的診斷及其預(yù)后判定。

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表觀遺傳學(xué)研究方法范文第5篇

[關(guān)鍵詞] 宮頸癌；DKK-3基因啟動(dòng)子；甲基化；臨床意義

[中圖分類號(hào)] R711.74 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2013）12（b）-0087-03

宮頸癌的發(fā)病機(jī)制與基因啟動(dòng)子甲基化等表觀遺傳學(xué)改變密切相關(guān)，目前發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的基因參與了宮頸癌的發(fā)病，可作為宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估的標(biāo)志物[1-2]。Dickkopf相關(guān)蛋白3（Dickkopf-related protein 3，DKK-3）基因具有抑制細(xì)胞增殖作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后緊密相關(guān)，其基因啟動(dòng)子甲基化在多種腫瘤中可反映病情及預(yù)后，成為腫瘤基因水平的標(biāo)志物[3-4]。本研究比較了宮頸癌患者和健康女性的DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，研究DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌中的臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2009年1月～2012年12月確診的80例宮頸癌患者為研究對(duì)象，均經(jīng)臨床表現(xiàn)、體格檢查、影像學(xué)檢查、細(xì)胞學(xué)和病理組織學(xué)檢查確診，年齡31～80歲，平均（50.9±12.7）歲；病理類型：鱗癌53例，腺癌16例，腺鱗癌11例；根據(jù)FIGO 2009分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期16例，Ⅱ期33例，Ⅲ期21例，Ⅳ期10例。另以同期參加健康體檢的80例健康女性作為比較對(duì)象，年齡30～80歲，平均（51.1±14.6歲）。兩組研究對(duì)象在年齡等一般資料方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)方法

對(duì)所有研究對(duì)象宮頸取活檢組織或術(shù)后病理標(biāo)本后立即提取基因組DNA，采用甲基化特異性PCR檢測(cè)DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化。將提取的基因組DNA行重硫酸鹽轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物采用Methprimer設(shè)計(jì)，序列見(jiàn)表1，反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性12 min，95℃變性1 min，64℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，最后一輪72℃延伸10 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法計(jì)算，以P

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌患者和健康女性DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化的比較

宮頸癌患者中有49例宮頸活檢組織檢測(cè)到DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化，甲基化率為61.3%；健康女性中有2例檢測(cè)到DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化，甲基化率為2.5%，宮頸癌患者DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于健康女性（P

2.2 不同臨床病理因素中DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化差異的比較

宮頸癌患者宮頸活檢組織DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化率在年齡、吸煙史、酗酒史和病理類型中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在HPV感染、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和FIGO分期中的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)最主要的調(diào)控基因表達(dá)方式，是一種非DNA序列改變的轉(zhuǎn)錄前基因調(diào)控，甲基化CG位點(diǎn)導(dǎo)致DNA序列致密化，結(jié)合甲基結(jié)合蛋白后可阻遏轉(zhuǎn)錄因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物從而抑制基因表達(dá)，目前研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化調(diào)控主要集中在富含CG位點(diǎn)的基因啟動(dòng)子區(qū)域[5]。大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致基因處于表達(dá)抑制狀態(tài)，抑癌基因的表達(dá)下降導(dǎo)致正常細(xì)胞失去調(diào)控而癌變，在眾多腫瘤中可檢測(cè)到抑癌基因啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)[6-7]。DKK-3屬于DKK基因家族成員之一，經(jīng)典的DKK家族被認(rèn)為是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控因子，但目前對(duì)DKK-3的功能尚未完全清楚，大多數(shù)研究表明其具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡和腫瘤血管產(chǎn)生的作用，在多種腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)為低表達(dá)狀態(tài)[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)，DKK-3基因啟動(dòng)子在消化道腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤等眾多腫瘤中處于高甲基化狀態(tài)，且其甲基化與病情及預(yù)后緊密相關(guān)，可作為這些腫瘤的生物標(biāo)志物，較傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)水平分子標(biāo)志物具有更高的靈敏度及特異性[9]。本研究提示，宮頸癌患者DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于健康女性，表明與其他腫瘤基本相似，宮頸癌患者DKK-3基因啟動(dòng)子處于高甲基化抑制狀態(tài)。

本研究比較了不同臨床病理因素下DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化率的差異，發(fā)現(xiàn)分化程度越低、腫瘤直徑越大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及FIGO分期晚的宮頸癌患者DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化率高于分化程度越高、腫瘤直徑越小、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及FIGO分期早的患者，這些證據(jù)表明DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化與宮頸癌的病情及預(yù)后密切相關(guān)。因?yàn)槟[瘤的分化程度和臨床分期是目前公認(rèn)的與宮頸癌病情及預(yù)后的指標(biāo)，DKK-3基因啟動(dòng)子甲基化可作為宮頸癌的生物標(biāo)志物，可為宮頸癌的診斷、病情與預(yù)后評(píng)估提供證據(jù)，值得一提的是本研究樣本數(shù)較少，且缺乏遠(yuǎn)期隨訪證據(jù)，該結(jié)論有待進(jìn)一步研究。

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