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      氯化兩面針堿體外腎毒性探討論文

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      氯化兩面針堿體外腎毒性探討論文

      【摘要】目的觀察氯化兩面針堿在體外對人胚腎細胞293的毒性作用。方法采用MTT法檢測不同濃度氯化兩面針堿對人胚腎細胞293的毒性。結果氯化兩面針堿在體外對人胚腎細胞293有一定的毒性作用。結論氯化兩面針堿可抑制人胚腎細胞293的增殖,對腎臟有一定的毒性。

      【關鍵詞】氯化兩面針堿;人胚腎細胞293;體外腎毒性

      中藥抗腫瘤是目前醫學界研究的一個熱點,很多中藥成分被證實具有較好的抗腫瘤效果而得以逐步走向臨床。氯化兩面針堿是兩面針制劑的主要有效成分,在抗炎、鎮痛、抗腫瘤、心血管系統等方面的作用已有較多報道。氯化兩面針堿有較強的抗癌作用,據文獻[1]報道,氯化兩面針堿對LEWIS肺癌、鼻咽癌、肝癌、慢性粒細胞白血病均有抑制作用,對小鼠艾氏水癌、肝癌腹水也有效,而其對腎的毒性問題未見報道,特別是在細胞水平、分子水平都未見報道。作為一個新型的抗腫瘤藥物,其腎毒性大小至關重要。本實驗中,我們考察了氯化兩面針堿在體外對人胚腎細胞293的毒性作用。

      1材料與儀器

      1.1試藥氯化兩面針堿標準品(中國藥品生物制品檢定所);四噻唑藍(MTT)(Sigma公司);二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司);DMEM(美國GIBCOBRL公司);胎生牛血清(杭州四季青生物材料研究所公司);胰蛋白酶(美國Amresco公司公司);谷氨酰胺(美國Amresco公司);PBS(美國Amresco公司);注射用青霉素鈉(華北制藥股份有限公司);注射用硫酸鏈霉素(大連美羅大藥廠);HEPES(Sigma公司)。

      1.2儀器二氧化碳培養箱(美國FormaScientific公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);酶標儀(芬蘭thermo公司);超低溫冰箱(日本三洋公司);96孔培養板(美國BIO-RAD公司);6孔培養板(美國BIO-RAD公司);超凈工作臺(蘇州凈化設備廠);臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);電熱恒溫水浴鍋(北京市醫療設備廠)。

      1.3細胞株人胚腎細胞293細胞株(南京凱基生物科技發展有限公司)。

      2方法

      2.1DMEM培養液的配置DMEM培養干粉以1000ml三蒸水充分溶解,加入NaHCO32.0g,HEPES4.766g,加入青霉素、鏈霉素使其終濃度為100U·ml-1,在超凈工作臺中過慮除菌,分裝成90ml/瓶,-20℃保存備用,臨用前加10ml熱滅活(56℃,30min)胎牛血清。

      2.2梯度氯化兩面針堿的制備精密稱定氯化兩面針堿標準品適量用DMSO溶解后,用無血清培養液依次稀釋,配置成0.78125,1.5625,3.125,6.25,12.5μg/ml濃度梯度的氯化兩面針堿系列濃度樣品,置于4℃冰箱中保存備用。

      2.3細胞培養人正常胚腎細胞293分別培養于含DMEM完全培養液的玻璃培養瓶中,置于37℃,飽和濕度,5%CO2的培養箱中,定期觀察更換培養液。細胞鋪滿培養瓶底部時傳代,用PBS沖洗兩次,加入0.25%胰蛋白酶2ml消化液,置37℃約1min,倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若胞質回縮,細胞間連接消失,表明此時細胞消化適度,吸取上清液,加入完全培養液2ml,反復吹打,將細胞吹打均勻,調整培養瓶中細胞濃度至1×105/ml,加入完全培養液,置于CO2的培養箱。實驗中所用細胞均處于對數生長期,活細胞數大于95%。

      2.4氯化兩面針堿的腎毒性實驗(MTT法)取對數生長期的人正常胚腎細胞293用胰酶消化后,用DMEM培養液吹打制成細胞懸液加入96孔培養板,每孔190μl,在5%CO2、37℃培養箱培養24h待細胞完全貼壁后,受試孔加入系列濃度受試藥物10μl每藥3孔,陰性對照孔加入含0.5%DMSO的無血清培養基10μl,空白對照孔加入等量的含藥無血清培養基而無細胞,各孔加培養基至200μl,培養箱孵育24,48,72h,加入5mg/ml的MTT10μl,繼續在培養箱培養4h,取出96孔板頃去上清液,加入DMSO每孔150μl,在搖床上振動搖勻10min,在酶標儀570nm和630nm的波長下測得各孔OD值。按下式計算藥物對293細胞的抑制率。

      抑制率(%)=對照組OD值-實驗組OD值對照組OD值×100%

      實驗重復3次,計算平均抑制率。

      2.5SOD,MDA,LDH的測定(紫外分光光度法)取對數生長期的人正常胚腎細胞293用胰酶消化后,用DMEM培養液吹打制成細胞懸液加入6孔培養板,每孔1.9ml,在5%CO2,37℃培養箱培養24h待細胞完全貼壁后,實驗孔加入3.125μg/ml氯化兩面針堿0.1ml,另設空白對照組。在藥物作用的12,24,48h后,取培養液的上清液按SOD,MDA,LDH試劑盒中所述方法進行SOD,MDA,LDH的測定。

      2.6統計學軟件處理數據數據以±s表示,組間的均數采用方差分析進行兩兩比較,采用SPSS13.0軟件進行處理。采用Bliss法計算IC50值。

      3結果

      3.1MTT測定結果藥物干預組與空白對照組比較,在0.78125~12.5μg/ml濃度范圍內,吸收度A值隨藥物濃度的增加逐漸減小,說明氯化兩面針堿對人正常胚腎細胞293有一定的毒性作用,且隨氯化兩面針堿濃度的增大對細胞的毒性增加。結果見表1。表1MTT法測定氯化兩面針堿對293細胞株的毒性作用

      3.2SOD,MDA,LDH的測定結果結果見表2。表2紫外分光光度法測定氯化兩面針堿對人胚腎細胞293毒性作用

      3.3藥物作用前后腎細胞的變化正常的腎細胞為不規則多邊形,藥物作用前的腎細胞在倒置顯微鏡下觀察可見為不規則多邊形,胞漿豐富,單核、雙核細胞較多見,偶可見多核細胞,細胞核圓、透亮,培養12h后可見細胞開始貼壁,貼壁細胞透亮、呈不規則多角形,邊界清晰,胞漿內容物豐富,少許未貼壁細胞浮于液面。培養24h的肝細胞大部分貼壁。見圖1。藥物作用12h后腎細胞開始萎縮,細胞膜完整,出現發泡現象,并有膜包裹的凋亡小體出現,細胞密度下降。藥物作用24h后腎細胞隨時間的延長,細胞形態改變和細胞密度下降較明顯,出現較多凋亡小體懸浮于培養液中。藥物作用48h后腎細胞死亡較多,密度進一步降低,出現較多凋亡小體懸浮于培養液中,培養液出現渾濁現象。結果見圖1~4。

      4討論

      腎臟是人體重要臟器之一,更是主要的排泄器官。藥物在體內經腎臟代謝,多數藥物以原形或分解產物形式從腎臟排泄出體外,但許多藥物具有腎毒性,如過量使用(尤其在患腎病時),會對腎產生毒性作用,繼而引起或加重腎損害。中草藥引起的腎損害與用藥劑量的大小,持續時間的長短、性別、個體敏感性有關。當劑量達到一定程度后即可引起腎損害。曾有報道一次用木通60g可引起急性腎衰竭。通常認為中藥毒性小,用量有日益增大的趨勢。故使用中藥應遵循少而精的原則,要時刻考慮是否會加重腎臟負擔或是否可引起不可逆的腎損害。

      考察藥物的毒性是確定該藥物有無繼續研究和開發價值的重要因素,早期發現和掌握藥物的有關毒理學資料對于后續研究有著重要的指導意義,因此建立一個良好的實驗模型檢測藥物毒性對于新藥的研究與開發具有重要意義。腎為人體重要的代謝器官,所以考察一個藥物的毒性大小以腎細胞為對象具有代表性作用。腎毒性檢測是研究新化合物毒理學的重要組成部分,而通過體外腎細胞模型進行新化合物的腎毒性研究更是有著自身的眾多優點。本實驗中,我們選取了人胚腎細胞293為實驗對象,考察氯化兩面針堿對正常細胞的毒性作用。

      通過測定加入藥物作用后的6孔板中培養上清液的SOD,MDA,LDH值可以看出,加入藥物后,可以抑制腎細胞的增殖,與未加藥物作用的值比較,兩者具有顯著性差異。說明氯化兩面針堿具有一定的腎毒性。本實驗結果可為臨床應用提供參考。超級秘書網:

      【參考文獻】

      [1]楊倉良.毒藥本草[M].北京:中國中醫藥出版社,1993:431

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