酶法工藝頭孢丙烯中酶蛋白殘留的檢測(cè)

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[摘要]目的：建立一種酶法工藝制備的頭孢丙烯中酶蛋白殘留的新檢測(cè)方法。方法：采用考馬斯亮藍(lán)法，配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白線性溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，取考馬斯亮藍(lán)G-250染液加入到10%碳酸氫鈉溶液溶解的頭孢丙烯供試品溶液中，混勻反應(yīng)10分鐘后使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得到供試品溶液中的蛋白濃度，并計(jì)算出供試品所含酶蛋白殘留含量。結(jié)果：酶蛋白在25~1000μg/mL(相當(dāng)于供試品0.05%~2.0%)濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系(r=0.9976)；精密度RSD(n=12)為4.5%；平均回收率(n=12)為98.9%。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)單便捷、重復(fù)性好、快速準(zhǔn)確，適用于酶法工藝制備的頭孢丙烯中酶蛋白殘留的含量測(cè)定。

[關(guān)鍵詞]頭孢丙烯；酶法；蛋白殘留；含量測(cè)定

頭孢丙烯是美國(guó)百時(shí)美-施貴寶公司研制的第二代非酯型口服頭孢菌素類(lèi)廣譜抗菌藥(圖1)，也是FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)可有用于治療兒童中耳炎和鼻竇炎的口服頭孢菌素類(lèi)抗生素，臨床上主要用于敏感細(xì)菌引起的呼吸道、皮膚和軟組織等感染[1]。目前已報(bào)道的合成頭孢丙烯的方法主要是采用化學(xué)合成法[2-3]，該合成法反應(yīng)過(guò)程多，使用有機(jī)溶劑量大，產(chǎn)生的危險(xiǎn)廢物多，對(duì)環(huán)境不友好。近年也有新的綠色環(huán)保的酶法合成頭孢丙烯制備工藝報(bào)道[4-6]。酶法合成相對(duì)化學(xué)合成，使用的有機(jī)溶劑少，路線簡(jiǎn)單，能克服現(xiàn)有的化學(xué)合成法成本高、大量使用有毒試劑、生產(chǎn)周期長(zhǎng)的不足，滿足經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和社會(huì)進(jìn)步的需要。但是酶法合成頭孢丙烯的工藝中，使用到合成酶，其結(jié)構(gòu)以蛋白質(zhì)為主。如若較多殘留至成品中，服藥后有可能導(dǎo)致患者過(guò)敏等不良反應(yīng)。因此，為了更好地控制酶法工藝制備的頭孢丙烯的藥品質(zhì)量，有必要建立一種檢測(cè)方法，以檢測(cè)酶法制備的頭孢丙烯最終產(chǎn)品中酶蛋白的殘留量，從而保證用藥的安全性。目前，蛋白質(zhì)的定量測(cè)定有多種方法，如考馬斯亮藍(lán)(Bradford)法[7]、福林酚(Lowry)法[8]、凝膠過(guò)濾(GFC)法[9]、熒光法[10]、質(zhì)譜法(MS)等[11]。考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量是通過(guò)染料結(jié)合進(jìn)行的，在游離狀態(tài)下呈現(xiàn)紅色，最大光吸收波長(zhǎng)在488nm，當(dāng)考馬斯亮藍(lán)G-250與蛋白質(zhì)結(jié)合后變成藍(lán)色，該蛋白質(zhì)-色素的結(jié)合物在595nm吸收波長(zhǎng)下有最大吸收，其吸光度值與蛋白質(zhì)的含量成正比[7]。其作為一種通用型方法，只需加一種檢測(cè)試劑就可以實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)單、方便的測(cè)定；靈敏度高，約為福林酚法的4倍；受干擾的物質(zhì)少，優(yōu)點(diǎn)突出，可以作為蛋白質(zhì)含量測(cè)定的首選。牛血清白蛋白是極為常用的標(biāo)準(zhǔn)參照蛋白，一般蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法所選取的稀釋劑多以水為主，而頭孢丙烯的溶解特性為微溶于水，因此需要選取合適的溶劑，既不能讓殘留的蛋白質(zhì)變性，又能充分溶解頭孢丙烯，使酶蛋白殘留的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。本文采用考馬斯亮藍(lán)法，通過(guò)考察選擇合適的溶劑、建立了酶法工藝制備頭孢丙烯酶蛋白殘留的檢測(cè)方法，快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，并已用于實(shí)際樣品酶蛋白殘留的測(cè)定。

1儀器與試劑

1.1儀器。紫外分光光度計(jì)(島津UV-1800)、電子天平(梅特勒托利多)

1.2試劑。牛血清白蛋白：生物技術(shù)級(jí)96%，阿拉丁；考馬斯亮藍(lán)G-250：上海綠鳥(niǎo)科技；磷酸：阿拉丁；乙醇：上海凱沃生物；碳酸氫鈉：廣州化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水：實(shí)驗(yàn)室超純水一體機(jī)自制純化水；頭孢丙烯供試品：自制樣品S190701、S190702、S190703。

2方法與討論

2.1溶液配制。考馬斯亮藍(lán)G-250染液：稱(chēng)取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50mL乙醇中，加入磷酸100mL，用純化水稀釋定容至1000mL。10%碳酸氫鈉溶液：取碳酸氫鈉10g，加水100mL溶解，即得。

2.2空白溶液配制。取10mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，置西林瓶中，加入200μL10%碳酸氫鈉溶液，密封混勻，放置10min后，即得空白溶液。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液及供試品溶液配制。取牛血清白蛋白適量，用純化水溶解定容，得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備溶液，取上述儲(chǔ)備溶液適量，以10%碳酸氫鈉溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)吹脴?biāo)準(zhǔn)蛋白線性溶液；另取10mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，置西林瓶中，加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白線性溶液200μL，密封，混勻；放置10分鐘后，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。取頭孢丙烯供試品(批號(hào)：S190703)500mg，精密稱(chēng)定，置10mL容量瓶中，加10%碳酸氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液；取10mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，置西林瓶中，加入200μL供試品溶液，密封混勻，放置10分鐘后，作為供試品測(cè)定溶液。

2.4檢測(cè)條件紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：595nm

2.5稀釋溶劑的選擇。因蛋白質(zhì)在酸、堿、丙酮等物質(zhì)中均易變性，實(shí)驗(yàn)考察了多種溶劑如不同濃度的磷酸、冰乙酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉等溶劑，分別配制牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液和供試品溶液，結(jié)果在上述溶劑中10%碳酸氫鈉溶液不但紫外響應(yīng)高、吸光度與濃度亦呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，而且對(duì)頭孢丙烯的溶解度很大，較好地滿足了酶蛋白殘留的檢測(cè)要求。通過(guò)比較與選擇，最終選定了10%碳酸氫鈉溶液作為溶劑。

2.6放置反應(yīng)時(shí)間的選擇。考馬斯亮藍(lán)法中染液與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)間較短，幾分鐘內(nèi)可完成，結(jié)合以后的顏色可保持1小時(shí)穩(wěn)定。選定溶劑后對(duì)放置時(shí)間進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示在5~20分鐘內(nèi)吸光度結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，綜合測(cè)定的快速性、反應(yīng)充分性和結(jié)果的穩(wěn)定性，最終選定放置10分鐘。

3驗(yàn)證結(jié)果

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。稱(chēng)量牛血清白蛋白適量，用純化水溶解定容至50mL容量瓶中，得到濃度約為2500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白儲(chǔ)備溶液。按下表分別取適量，以10%碳酸氫鈉溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)驳?份標(biāo)準(zhǔn)蛋白線性溶液；各取10mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，分別置7個(gè)西林瓶中，分別加入下表1各標(biāo)準(zhǔn)蛋白線性溶液200μL，密封，混勻；放置10min后，即得7份標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。紫外分光光度計(jì)在595nm波長(zhǎng)下，經(jīng)過(guò)空白溶液校正后，取該7份標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液分別放入紫外分光光度計(jì)讀取吸光度值，檢測(cè)結(jié)果如下表2：以蛋白溶度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，采用吸光度對(duì)蛋白溶液溶度以最小二乘法做線性回歸(圖1)，得線性回歸方程：y=0.000538852x+0.0244872(r2=0.9952)。結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶度在24.8~993.5μg/mL的范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，可適用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

3.2精密度。3.2.1分析重復(fù)性按3.1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，取供試品，按2方法測(cè)定其蛋白殘留，供試品蛋白殘留濃度為22.76μg/mL，酶蛋白殘留0.045%；取同一供試品平行配制6份供試品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法，分別取10mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，分別置6個(gè)西林瓶中，分別加入100μL標(biāo)準(zhǔn)曲線中的相當(dāng)于供試品0.2%的線性溶液以及100μL上述供試品溶液，均密封混勻，放置10min后，得到6份分析重復(fù)性溶液，取這6份分析重復(fù)性溶液測(cè)定吸光度值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到分析重復(fù)性溶液中所含蛋白濃度；分析重復(fù)性溶液的蛋白濃度減去對(duì)應(yīng)供試品溶液所含蛋白濃度，得到實(shí)際加入的線性溶液的蛋白濃度，實(shí)際加入的蛋白濃度與理論加入的蛋白濃度的比值為回收率。如下表3所示，各分析重復(fù)性溶液的平均回收率為102.6%，RSD為4.6%，本方法的分析重復(fù)性良好。3.2.2中間精密度在不同日期不同實(shí)驗(yàn)員按照3.2.1進(jìn)行供試品蛋白殘留測(cè)定，供試品蛋白殘留濃度為22.66μg/mL，酶蛋白殘留0.045%；按照3.2.1平行配制6份中間精密度溶液測(cè)定并計(jì)算回收率。如下表4所示，各中間精密度溶液的平均回收率為97.6%，RSD為3.0%，本方法的中間精密度良好。綜合12份溶液平均回收率為100.1，RSD為4.5%，本方法的精密度良好。

3.3回收率。按3.1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，取供試品，按2方法測(cè)定其蛋白殘留為22.76μg/mL。準(zhǔn)確度溶液1配制：取10mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，置西林瓶中，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)曲線中的相當(dāng)于供試品0.05%的線性溶液以及100μL上述供試品溶液，密封混勻，放置10min后，得到準(zhǔn)確度溶液1；平行配制3份；準(zhǔn)確度溶液2配制：取10mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，置西林瓶中，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)曲線中的相當(dāng)于供試品0.2%的線性溶液以及100μL上述供試品溶液，密封混勻，放置10min后，得到準(zhǔn)確度溶液2；平行配制3份；準(zhǔn)確度溶液3配制：取10mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，置西林瓶中，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)曲線中的相當(dāng)于供試品1.2%的線性溶液以及100μL上述供試品溶液，密封混勻，放置10min后，得到準(zhǔn)確度溶液3；平行配制3份；準(zhǔn)確度溶液4配制：取10mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，置西林瓶中，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)曲線中的相當(dāng)于供試品2.0%的線性溶液以及100μL上述供試品溶液，密封混勻，放置10min后，得到準(zhǔn)確度溶液4；平行配制3份；取上述12份準(zhǔn)確度溶液測(cè)定吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到準(zhǔn)確度溶液中所含蛋白濃度；準(zhǔn)確度溶液所含的蛋白濃度減去供試品溶液所含蛋白濃度，得到實(shí)際加入的線性溶液的蛋白濃度，實(shí)際加入的蛋白濃度與理論加入的蛋白濃度的比值為回收率。如下表6所示，各準(zhǔn)確度溶液平均回收率為98.9%，RSD為4.1%，回收率的95%置信區(qū)間在96.3%~101.5%，表明該方法測(cè)定頭孢丙烯酶蛋白殘留準(zhǔn)確、可靠。

3.4樣品檢測(cè)。按3.1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，取各供試品，按2方法配制供試品溶液并測(cè)定其蛋白殘留，如下表7所示。

4結(jié)論

本論文中，我們采用考馬斯亮藍(lán)法，使用10%碳酸氫鈉溶液作為溶劑對(duì)酶法工藝制備頭孢丙烯中酶蛋白殘留進(jìn)行了測(cè)定。在此條件下，方法簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好、結(jié)果快速準(zhǔn)確，適用于酶法工藝制備頭孢丙烯中酶蛋白殘留的測(cè)定，為頭孢丙烯藥物研發(fā)、生產(chǎn)樣品的質(zhì)量控制提供了參考。

作者:李慶 關(guān)晴 刁富城 單位:廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司白云山化學(xué)制藥廠