導(dǎo)向溶栓

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早期溶栓治療，可以縮小心肌梗塞面積、維護(hù)左室功能、降低死亡率，因而成為急性心肌梗塞的標(biāo)準(zhǔn)療法之一。然而當(dāng)前應(yīng)用的溶栓劑仍存在明顯的缺陷，主要是特異性差，要達(dá)到完全溶解血栓的目的，常需較大劑量連續(xù)靜脈給藥，因而增加了全身纖維系統(tǒng)激活致出血的危險性。如何將栓劑特異性靶向到血栓部位，一者提高溶栓效力，二者降低全身出血等副反應(yīng)，一直是該領(lǐng)域研究的熱點，近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，為解決溶栓導(dǎo)向性問題提供了很多有效途徑，茲就這方面的研究進(jìn)展作一簡要綜述。

1靶向溶栓劑的構(gòu)建

近年來，運用分子生物學(xué)理論和基因工程技術(shù)，對現(xiàn)有的溶栓劑分子進(jìn)行重組和修飾，通過增加纖維蛋白結(jié)合位點或?qū)⑷芩▌┡c特異性抗體連接，構(gòu)建了很多新型的，特異的靶向溶栓劑。

1.1t-PA/u-PA雜合體：t-PA和u-PA是兩種主要的生理性纖溶酶原活化劑，均可通過裂解Arg-Val鍵而將纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，但二者又有其各自的特點。t-PA具有對纖維蛋白特異性親和作用，這是由于t-PA分子的環(huán)餅結(jié)構(gòu)域（Kringlez）帶有一個賴氨酸結(jié)合位點（LBS），可介導(dǎo)與纖維蛋白結(jié)合；u-PA對纖維蛋白沒有特異性，但對纖溶酶原具有很強的專一催化作用。為了充分利用二者的長處，Agnelli等[1]構(gòu)建了由來片t-PAa鏈及u-PA的絲氨酸蛋白酶部分組成的雜合體，動物體內(nèi)實驗表明，其溶栓效力提高了3-16倍，循環(huán)半衰期延長6-20倍。但也有些類似的雜合體并顯示出纖維蛋白特異性親和性。Novokhatry等[2]通過差異掃描測熱法（differentialscanningcalorimetry）研究了這種雜合蛋白分子內(nèi)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用，結(jié)果顯示t-PA的LBS與來自u-PA的leu144-lys157的殘基結(jié)合，從而封閉了LBS，使其與纖維蛋白的親和性減弱。

1.2特異性抗體靶向溶栓劑：利用單克降抗體與其相應(yīng)抗原的高度特異性親和作用來實現(xiàn)溶栓劑的靶向作用。一種方法是將抗體通過化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)至溶栓劑分子上，但由于來源于動物的單克隆抗體的異體成分會引起人體的免疫反應(yīng)，故近來多應(yīng)用基因工程技術(shù)將編碼抗體結(jié)合位點和纖溶酶原激活劑催化位點的兩種基因雜交后表達(dá)出融合蛋白，這樣可以以人的免疫球蛋白代替大部分抗體的異體結(jié)構(gòu)，減少免疫反應(yīng)[3]。Holvoet等[4]應(yīng)用基因重組技術(shù)構(gòu)建了兩個重組的雜合分子：K12G0S32和K12G2S32，前者是由scu-PA的低分子量衍生物（Ala132→Leu441）與纖維蛋白片段D-二聚體特異性單克隆抗體的可變區(qū)片段Fv組成的雜合分子；后者是用Glu取體Asn88，從而使Fv脫糖基化。體內(nèi)外溶栓實驗表明：K12G0S32的溶栓效力較rscu-PA提高了10倍，而K12G2S32提高了2倍，但K12G2S32的血漿半衰期較rscu-PA延長了4倍。提示這種雜合的抗體靶向性PA不僅可增加特異性溶栓效力，而且可減少清除率。

此外，大量研究證明，血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（ACE）的單克隆抗體靜脈注射后能積聚在多種動物的肺部。Muzykanktor等[5]根據(jù)一特性，使用Streptavidin作用交聯(lián)劑，將scu-PA、t-PA及SK分別與抗ACE單克隆抗體交聯(lián)，動物體內(nèi)實驗表明，這些交聯(lián)物對肺血管有特異靶向性，并且延長了在肺血管床滯留的時間，為肺栓塞的纖溶治療提供了一個研究基礎(chǔ)。

1.3t-PA/P-selectin融合蛋白：P-selectin是血管粘附蛋白選擇素家族中的成員之一，是一種分子量為140kD的糖蛋白。P-selectin主要存在于血小板的a顆粒及內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-Palade小體中，內(nèi)皮細(xì)胞及血小板受環(huán)境刺激活化時，P-selectin迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面，在血栓形成初期的白細(xì)胞貼壁流動中起著非常重要的作用。P-selectin的配基主要存在于白細(xì)胞，單核細(xì)胞及某些淋巴細(xì)胞表面。Fujise等應(yīng)用基因工程技術(shù)表達(dá)出含t-PA及P-selectin的融合蛋白，體內(nèi)溶栓實驗表明，該雜合分子具備與t-PA一樣的溶栓活性，而且保存了P-selectin配基結(jié)合的能力，提示這種雜合蛋白可能提供一種靶向t-PA到血栓區(qū)域的有效方法。

1.4rscu-PA/AV雜合體：Annexin(AV)是從人胎盤中純化的一種抗凝蛋白，在Ca2+的存在下，其對裸露在活化血小板膜上的磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度的親和性，因而AV可作為一種靶向劑，將溶栓劑靶向到富含血小板的血栓。無論是應(yīng)用化學(xué)方法構(gòu)建的AV與UD交聯(lián)物[7]，還是應(yīng)用基因重組技術(shù)獲得的rscu-PA/AV雜合體[8]均獲得了交叉分子的酶活性及膜結(jié)合活性，從而增加了對血栓的特異性，提高了溶栓效力。

1.5t-PA或u-PA突變體：Yamada等通過在t-PA分子中引入Arg-Gly-Asp(RGD)序列構(gòu)建了幾種突變體t-PA。實驗表明，這種突變體具有以RGK依賴的方式對血小板整合素（如α2Ⅱβ2）高度親和的特性。同時仍保留了t-PA一樣的纖溶活性，提示這種雙功能分子可用作血小板血栓的特異性溶栓劑。董晨等[10]將人工合成的編碼GPRP四肽的寡核苷酸序列連接至scu-PA(144-411)克隆脫氨核糖核酸（cDNA）的5''''端，并將其重組克隆到表達(dá)載體PKK233-2中，在大腸桿菌中得到5%的表達(dá)量。體外實驗表明，這種突變體纖溶效率為LUK的2-3倍，對纖維蛋白的親和性比LUK提高了6倍，且對纖維蛋白原親和力很強，提示GPRP四肽可提高尿激酶對纖維蛋白的專一性。

構(gòu)建具有趨血栓特異性的靶向溶栓劑是實驗導(dǎo)向溶栓的一個主要途徑，然而盡管應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建了很多這類新型靶向溶栓劑，但其溶栓效力及血栓特異性作用仍達(dá)不到理想的程度，因而仍處在實驗研究階段，未能應(yīng)用于臨床。

2脂質(zhì)體靶向攜載溶栓劑

脂質(zhì)體是一種由磷脂雙分子層組成的囊泡，由于其免疫原性低，體內(nèi)易代謝，無毒副作用，因而可作為一種理想的藥物載體。晚近，很多研究表明[11，12]，應(yīng)用脂質(zhì)體包裹t-PA或鏈激酶（SK），可大大降低出血等并發(fā)癥，同時促進(jìn)了SK被遞送到血栓及其附近的濃度。應(yīng)用的動物血栓模型觀察表明，脂質(zhì)體包裹SK恢復(fù)血管再通的時間只游離SK的50%。凌世長等[13]應(yīng)用RGDS多肽修飾的脂質(zhì)體包裹尿激酶（UK），利用RGDS與活化血小板表面的纖維蛋白原受體的特異性親和作用，引導(dǎo)脂質(zhì)體溶栓劑的靶向性溶栓效應(yīng)。

脂質(zhì)體靶向攜載溶栓劑為實現(xiàn)導(dǎo)向溶栓提供了一種新的方法，但由于仍然存在很多問題未得到解決，如脂質(zhì)體進(jìn)入血液循環(huán)后，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，在血栓部位不易達(dá)到有效濃度；另外，如何控制脂質(zhì)體在血栓部位釋放溶栓劑，仍未能解決，因而限制了該技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用。

3導(dǎo)管導(dǎo)向溶栓：

對于有些血栓性疾病，如肺栓塞，靜脈給藥常難湊效。應(yīng)用局部導(dǎo)管直接在血栓部位給藥，可大大減低藥物劑量，減輕副反應(yīng)，同時達(dá)到快速、完全溶栓之目的[14，15]。如Beitzke等通過局部導(dǎo)管給藥治療一例左肺動脈栓塞的3歲患兒，取得成功，血栓完全溶解，未出現(xiàn)任何副反應(yīng)。對于急性心肌梗塞（AMI）患者應(yīng)用溶栓治療可使血管再通，降低死亡率。但大樣本調(diào)查表明仍有20%-35%的病例溶栓失敗。而且還有10%-15%的病人出現(xiàn)再梗塞。近年來，主張對AMI應(yīng)用經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）直接治療。Grines等[16]對比了PTCA溶栓治療的效果，二者可獲同樣的治療效果；使用t-PA治療的病人2%發(fā)生顱內(nèi)出血，而PTCA組無事件發(fā)生。

應(yīng)用局部導(dǎo)管直接給藥或是經(jīng)PTCA直接消除血栓是治療血栓的最佳途徑，但需要較高的技術(shù)設(shè)備條件，而且對患者有一定創(chuàng)傷，不易普及開展。

4基因定位轉(zhuǎn)移

隨著分子生物學(xué)理論與技術(shù)的日益發(fā)展，應(yīng)用基因治療某些疾病成為可能。Dichek等[17]在體外應(yīng)用重組t-PA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)染動脈和靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞，并在stent和Graft膜上培養(yǎng)，培養(yǎng)后的內(nèi)皮細(xì)胞再植入動脈內(nèi)，其血中t-PA的濃度可升高10-30倍，并持續(xù)2-3個月，可以有效防止實驗性血栓形成與血管再狹窄。在此基礎(chǔ)上，有些學(xué)者提出能否將t-PA或prcu-PA的cDNA定向轉(zhuǎn)移到血栓部位，使其在該處表達(dá)溶栓劑，發(fā)揮直接溶栓作用，進(jìn)而防止再梗塞。目前仍未見成功的報導(dǎo)，但無疑是今后研究的方向。

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