捷安肽素抗真菌作用機理

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【摘要】目的研究捷安肽素的抗真菌作用機理。方法采用形態學方法和同位素標記法。顯微形態觀察經捷安肽素處理后的供試真菌的形態學變化。進一步采用14C同位素標記的特異底物“尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖”示蹤，研究捷安肽素對真菌(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶活性反應的影響。結果顯微形態觀察表明，經捷安肽素處理后，供試真菌呈現球形膨脹，而且隨著捷安肽素作用強度增強，球形膨脹的程度和發生頻率也增加，提示捷安肽素的作用位點在真菌細胞壁。同位素標記實驗表明，捷安肽素可抑制（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的活性，降低真菌細胞壁合成過程中（1,3）-β-D-葡聚糖的放射性摻入，對疫霉菌和辣椒炭疽病菌（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的抑制率分別達到77.7%和77.5%。結論捷安肽素的抗真菌作用機理為：抑制細胞（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的活性，破壞真菌細胞壁的合成，造成真菌細胞壁組分（1,3）-β-D-葡聚糖的缺損和病原真菌生長抑制。

【關鍵詞】捷安肽素；抗真菌作用機理；（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶

AResearchonMechanismofAntifungalPolypeptideJiean-peptide

DAIFu-ying1,ZHOUJin-yan2,TANHong2

（1.DepartmentofPathogenicBiology,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083；2.ChengduInstituteofBiology,CAS,Chengdu610041）

Abstract：ObjectiveToinvestigatetheantifungalmechanismofJiean-peptide.MethodsThemodeofactionofJiean-peptideagainst4phytopathogenicfilamentousfungiassociatedwithphytopathy:Phytophthorasp.,Colletotrichumgossypii,SouthwBotrytiscinereaandFusariumoxysporumf.sp.vasinfectumwasinvestigatedbythemethodofmorphologyandisotopelabelling.The(1,3)-β-D-glucansynthaseassaywasprocessedusingisotopelabelledsubstrate—urdinediphosphate(14C)glucosetostudytheeffectofJiean-peptideonfungal(1,3)-β-D-glucansynthase.ResultsMicrographicobservationrevealedthattheJiean-peptidemadethehyphalexpandedandglobular.The(1,3)-β-D-glucansynthaseassayshowedJiean-peptidecouldinhibittheactivityof(1,3)-β-D-glucansynthaseandreducetheradioactivityincorporationof(1,3)-β-D-glucan.TheinhibitionpercentagesofJiean-peptideagainstPhytophthorasp.andColletotrichumgossypiiSouthwwere77.7%and77.5%respectively.ConclusionTheantifungalmechanismofJiean-peptidewastheinhibitionofenzymeactivityof(1,3)-β-D-glucansynthase.

Keywords:Jiean-peptide；antifungalmechanism；(1,3)-β-D-glucansynthase

捷安肽素是一種由芽孢桿菌產生的抗真菌活性多肽，具有廣譜抗真菌活性，而且穩定性好、抑菌持久，具有很好的開發前景［1，2］。從捷安肽素對疫霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌等多種常見重要植物病原真菌的抑菌性能可知，捷安肽素可以通過抑制真菌孢子萌發、菌絲生長而發揮抗真菌生長作用。形態觀察發現，捷安肽素可以破壞真菌的細胞壁結構，使真菌細胞呈現原生質球狀［3］。（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶（EC2.4.1.34；尿苷二磷酸-葡萄糖/(1,3)-β-D-葡聚糖-3-β-葡糖基轉移酶）是一細胞膜結合酶，在細胞膜內側聚合UDPG形成葡聚糖纖維，葡聚糖纖維分泌出細胞膜形成網狀支架，對真菌細胞壁的完整性及保護真菌抵抗低滲透壓起重要作用［4，5］。本文作者采用形態學方法和同位素標記法研究捷安肽素對真菌細胞壁及其（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的作用，進一步深入探討捷安肽素的抗真菌作用機理，為捷安肽素的進一步開發提供理論基礎。

1材料

1.1菌種

疫霉菌（Phytophthorasp.）、辣椒炭疽病菌（ColletotrichumgossypiiSouthw）、灰霉菌（Botrytiscinerea）、棉花枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum），均為本實驗室保藏菌種。

1.2培養基

馬鈴薯葡萄糖液體培養基。

1.3主要試劑

捷安肽素原液（生物效價為19.5mm）由本實驗室提供；尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖［UDP-（14C）-G］，Perkin-Elmer進口產品；2,5-二苯基唑（2,5-Di-phenyloxazole,PPO），Fisher進口產品。（捷安肽素的生物效價采用管碟法［2］測定，以疫霉菌為檢驗菌株，以抑菌圈直徑為效價指標）。

1.4主要溶液

粗酶提取緩沖液5×10-2mol/LTris-HClpH7.5,1mol/L葡萄糖，1×10-3mol/LEDTA，5×10-3mol/LMgCl2,1×10-2mol/LNaF,層析展開劑95%乙醇,1mol冰醋酸（7∶3，V/V）,閃爍液1gPPO，200ml甲苯。

1.5主要儀器

SHZ-82大容量回旋振蕩器德國ZAISS,AXIOPLAN2型多功能顯微鏡,PHS-3精密數顯酸度計Sigma3K30高速冷凍離心機,FJ-353G1型雙道液體閃爍計數器等。

2方法

2.1捷安肽素作用下供試菌的形態觀察

將疫霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌接種于馬鈴薯液體培養基(終孢子濃度為106個/ml)，25℃150r/min振蕩培養48h。每隔2h取樣，用0.05%的乳酚藍染色液對樣品進行固定、染色、顯微觀察孢子萌發情況和菌絲生長情況。設置3個實驗組，捷安肽素的處理濃度分別為原液濃度、1/2原液濃度和空白對照。

2.2捷安肽素樣品的處理

將捷安肽素樣品分為兩組，組Ⅰ不做任何處理,生物效價為19.5mm；組Ⅱ用30%的NaOH調pH為10，再以15%的HCl調pH為7.5，生物效價為零。

2.3制備（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶粗酶液

分別接種疫霉菌和辣椒炭疽病菌于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，疫霉菌30℃、150r/min振蕩培養30h；辣椒炭疽病菌25℃、150r/min振蕩培養36h,收集培養液，離心洗滌獲得菌絲體。(1,3）-β-D-葡聚糖合成酶粗酶液的制備采用文獻［6］的方法，經適當改進。液氮研磨菌絲體后加入粗酶提取緩沖液，充分振蕩混勻于4℃、3500g離心10min。收集上清夜，再將上清液于4℃、50000g離心45min。所得沉淀為粗酶制品,懸浮于503×10－3mol/LTris-HclpH7.5（含33%的甘油）中，用Bradford法測定酶蛋白含量，蛋白濃度控制在3～5μg/μl,于-70℃保存備用。

2.4（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶粗酶的活性測定采用14C標記的特異底物UDPG，與(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶進行酶反應，閃爍計數檢測反應產物(1,3)-β-D-葡聚糖的放射性，確定(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶粗酶液的活性。

2.4.1(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶反應［7］

反應體系40μl，包括253×10－3mol/LTris-HClpH7.5,0.5mol/L葡萄糖，103×10－3mol/LNaF,5mg/mlBSA,740BqUDP-（14C）-G和10μl(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶粗酶液。以加入10μl雙蒸水的反應組作為(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶粗酶液的空白對照組，以加入10μl沸水浴30min滅活的粗酶液的反應組作為(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶粗酶液的陰性對照組。每組反應重復2次。反應系統于30℃保溫30min，最后加入4μl冰乙酸終止反應。

2.4.2(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶反應產物的分離和放射性測定反應終止后，按文獻［8］的方法進行反應產物的分離。將反應液點樣于新華3號濾紙上，下行層析過夜。取出濾紙風干，剪下原點，于FJ-353G1型雙道液體閃爍計數器測定每分鐘閃爍次數（Cpm），表示同位素標記的(1,3)-β-D-葡聚糖的放射性強度，并以此衡量(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶的活性。FJ-353G1型雙道液體閃爍計數器對C14探測效率大于70%；閃爍液放射本底小于60次/min。

2.5捷安肽素對（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶反應的影響按2.3方法進行捷安肽素影響下的(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶反應和產物分離與放射性檢測。反應設置3組：捷安肽素處理組Ⅰ、捷安肽素處理組Ⅱ和捷安肽素空白對照組Ⅲ。實驗中捷安肽素或雙蒸水加樣量均為2μl，每組重復10次。根據反應產物的放射性計算產物的放射性摻入率和捷安肽素對酶反應的抑制率。摻入率=處理組產物放射性/對照組產物放射性×100%，抑制率=1-摻入率。2.6數據處理

采用統計分析軟件SPSS11.5進行數據的單因素方差分析。

3結果與分析

3.1捷安肽素對各病原菌形態的影響

光學顯微鏡觀察捷安肽素作用下各病原真菌的菌絲和孢子形態（0.05%的乳酚藍染色液染色），可見供試真菌的孢子和菌絲形態有顯著的變化，孢子和菌絲體膨大、畸形、原生質凝聚、孢子不萌發或萌發異常、菌絲上產生大量球形膨脹泡囊、生長受阻。隨著捷安肽素處理的時間增長或濃度加大這種球形膨脹的程度和發生頻率也增大。圖1所示為培養24h的供試病原真菌,捷安肽素處理濃度為1/2原液濃度，其中對照菌絲表面光滑、結構完整，處理菌絲均呈現不同程度的球形膨脹。眾所周知，真菌的細胞壁是細胞規范和維持形態所必需的,一旦細胞壁受損，細胞的原生質體在胞內滲透壓的作用下，便會形成球狀。由此推測捷安肽素破壞了供試真菌的細胞壁，從而使之呈現球形膨脹。

3.2（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶粗酶液的制備和活性采用2.3方法制備出疫霉菌和辣椒炭疽病菌菌絲的（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶粗酶液，經檢驗該（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶粗酶液的陰性對照組與空白對照組結果相同，反應產物的放射性均小于60Cpm，為閃爍液本底值，沒有酶活；實驗組反應產物的放射性為3000～5000Cpm，表明（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶粗酶具有催化活性，可用于進一步的實驗。

3.3捷安肽素對（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶反應的影響按照方法2.5，采用14C同位素標記的特異底物“UDP-（14C）-G”示蹤，用捷安肽素處理（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶反應，測定反應產物（1,3）-β-D-葡聚糖的放射性。結果表明疫霉菌（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶反應中，處理組Ⅰ、Ⅱ的放射性摻入（%空白對照）分別為22.3%±2.8%和96.0%±0.8%；辣椒炭疽病菌（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶反應中，處理組Ⅰ、Ⅱ的放射性摻入（%空白對照）分別為22.5%±2.5%和74.7%±3.0%，見圖2。

圖2捷安肽素對（1,3）-β-D-葡聚糖放射性摻入的影響

Fig.2TheeffectsofJiean-peptideon(1,3)-β-D-glucan''''sradioactiveincorporation

如圖2所示，在疫霉菌和辣椒炭疽病菌的（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶反應中，捷安肽素處理組Ⅰ、Ⅱ的放射性摻入均低于空白對照組Ⅲ，但其各自的組間差異不同。進一步采用統計分析軟件SPSS11.5對數據進行單因素方差分析，比較組間差異是否顯著，結果見表1和表2。表1捷安肽素對疫霉菌（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的影響從表1可知，疫霉菌（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶反應中，捷安肽素處理組Ⅰ和處理組Ⅱ之間、捷安肽素處理組Ⅰ和空白對照組Ⅲ之間均差異顯著（P1＜0.01,P2＜0.01,n=10），處理組Ⅱ和空白對照組Ⅲ之間差異不顯著（P3＞0.05,n=10），表明捷安肽素處理組Ⅰ可抑制反應產物的放射性摻入，抑制率為77.7%±2.8%；捷安肽素處理組Ⅱ不能抑制反應產物的放射性摻入，抑制率4%±0.8%屬于實驗誤差，不具有統計意義。表2捷安肽素對辣椒炭疽病菌（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶的影響從表2可知，辣椒炭疽病菌（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶反應中，捷安肽素處理組Ⅰ、處理組Ⅱ、空白對照組Ⅲ相互之間均差異顯著（P1＜0.01，P2＜0.01,P3＜0.01,n=10），表明捷安肽素處理組Ⅰ和捷安肽素處理組Ⅱ均可抑制反應產物的放射性摻入，抑制率分別為77.5%±2.5%和25.3%±3.0%。

在本實驗中，捷安肽素處理組Ⅰ(效價為19.5mm)對辣椒炭疽病菌和疫霉菌的（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶均具有抑制作用，這與它擁有生物活性的特性相一致。而捷安肽素處理組Ⅱ的效價為零，即沒有生物活性，但它對辣椒炭疽病菌的（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶卻表現出了抑制作用。分析原因可能是因為捷安肽素的生物效價測試菌為疫霉菌，捷安肽素無生物活性只是相對疫霉菌而言。而辣椒炭疽病菌對捷安肽素的敏感性不如疫霉菌對捷安肽素的敏感性高［3］，所以對于同一濃度捷安肽素處理Ⅱ，辣椒炭疽病菌的酶反應受抑，疫霉菌的酶反應不受抑制。

4討論

隨著現代科學技術的迅速發展，放射性核素正廣泛地應用于生物學、醫學和農學等學科的各個領域，大大地推動這些學科進入分子水平的新階段。酶的放射性分析方法［9］即是采用放射性標記底物與酶液在適宜的條件下保溫一段時間后，分離、測定酶催化底物所生成的產物的放射性而確定酶活性，是生物研究中最常用的方法。其它細胞壁相關酶類的分析法包括生物化學法、原位分析法、熒光染色等，但都不如放射性分析方法靈敏、快速、簡便。因此，本實驗采用酶的放射性分析方法研究捷安肽素的抗真菌作用機理：從疫霉菌和辣椒炭疽病菌中提取細胞壁合成中重要的（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶，采用14C放射性標記的特異底物“尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖”示蹤，研究捷安肽素對(1,3)-β-D-葡聚糖合成酶活性的影響。

已知抗真菌多肽的作用機理主要有兩種［10］：一種是干擾真菌的細胞壁組分葡聚糖、幾丁質和各種甘露蛋白的合成，導致細胞壁的缺損。如棘白霉素類化合物能結合β-1,3-D-葡聚糖合成酶復合體的Fksp亞基而干擾β-1,3-D-葡聚糖的合成，發揮抗真菌作用［11］。另一種是在細胞膜上形成電勢依賴的或其它的通道，改變細胞膜的通透性，使細胞內容物泄露。陳剛、裴炎等通過檢測抗真菌多肽APS對脂質平面膜電學性質的影響發現APS可在細胞膜上持續形成孔道（pores），破壞膜的完整性，引起細胞內容物的外流，最終導致真菌的死亡［12］。本實驗研究發現，捷安肽素可使疫霉菌和辣椒炭疽病菌的β-1,3-D-葡聚糖合成酶的反應產物的放射性摻入率降低。由此推測捷安肽素可能的抗真菌機理是：抑制真菌（1,3）-β-D-葡聚糖合成酶活性，造成真菌細胞壁組分（1,3）-β-D-葡聚糖的缺損，破壞真菌細胞壁的完整性，造成病原真菌生長抑制。真菌的細胞壁合成是一個非常復雜的過程，涉及許多酶類［13］，捷安肽素對真菌細胞壁合成相關的其它酶類如幾丁質合成酶等的酶活性有無作用還有待進一步研究。

植物真菌病害是目前較難防治的農作物病害，一直制約著農業經濟的發展。而過度地大量使用化學農藥，已造成了全球生態環境的不斷惡化及糧食危機，發展無公害生物農藥已是大勢所趨。捷安肽素抗真菌作用機理的初步闡明，有助于捷安肽素作用機理的更深層次的研究，有助于建立農用抗菌素的篩選模型、利用分子設計手段進行分子的改造和新的抗菌物質的合成，同時為捷安肽素開發為新型生物農藥提供生產、制劑、使用等方面的理論依據。同時，因為動物細胞沒有細胞壁，捷安肽素對真菌細胞壁合成的抑制作用，為捷安肽素向人藥發展提供了可能。

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