女貞子藥材熊果酸含量測定

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【摘要】目的為女貞子藥材的質量評價提供科學依據。方法以固相萃取（SPE）進行樣品供試液的前處理，采用RPHPLC法，分別測定齊墩果酸與熊果酸的含量，色譜柱：KromasilKR1005C18（4.6mm×250mm，5μm），流動相：［乙腈甲醇（體積比1∶1）水（體積比90∶10）］；流速：0.8mL/min；檢測波長：210nm；柱溫25℃；進樣量：2μL。結果樣品中齊墩果酸與熊果酸得到較好的分離；齊墩果酸在0.108～3.24μg的范圍內、熊果酸在0.060～1.800μg范圍內，與峰面積呈良好的線性關系；平均回收率分別為100.50％、98.05％；11批次樣品中齊墩果酸的含量為0.639～1.340mg/g，熊果酸的含量為0.168～0.377mg/g。結論采用SPE進行供試品溶液前處理，能夠有效消除女貞子藥材中雜質成分對末段吸收波長的干擾，所建立的方法具有簡便、穩定、可重復的特點，可用于女貞子藥材的質量控制。

【關鍵詞】女貞子；齊墩果酸；熊果酸；含量測定；固相萃取；HPLC

DeterminationofoleanolicacidandursolicacidinFructusligutriclucidibyRPHPLC

JIANGTiejun

(GuangzhouCheLiJiPharmaceuticalFactory,Guangzhou510290,China)

Abstract:ObjectiveTodeterminethecontentsofoleanolicacidandursolicacidinFructusligustriclucidiforthequalitycontrolofFructusligustriclucidi.MethodsandResultsOleanolicacidandursolicacidwereseparatedcompletelyunderselectedchoromatographycondition.Thecontentrangeofoleanolicacidinelevenbatchesofsampleswas6.39-13.40（mg/g）,andthecontentrangeofursolicacidwas1.68-3.77（mg/g）.ConclusionThismethodissimple,stable,accurateandreliableforthequalitycontrolofFructusligutriclucidi.

Keywords:Fructusligutriclucidi;oleanolicacid;ursolicacid;HPLC

女貞子為常用中藥，具有滋補肝腎、明目烏發的功效，用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發早白、目暗不明等證［1］724。女貞子中主要含有三萜類成分，其中齊墩果酸為主要的代表性成分，此外尚含有熊果酸等。有關女貞子藥材及含女貞子中藥復方制劑的質量多以齊墩果酸的含量作為評價指標［1］728。中國藥典2005年版（一部）［3］收載女貞子的含量測定方法為薄層掃描法測定齊墩果酸的含量。近年來，亦有文獻采用HPLCUV方法［4］以及HPLCELSD方法［5］測定本品中兩成分的含量，但由于HPLCUV測定波長在末端吸收，不能有效排除供試品中的雜質對測定結果準確度的影響；而ELSD檢測器還未能普遍應用。因此上述方法都有一定的局限性。

固相萃取（SPE）是一種新興的樣品前處理技術，近年來已經應用于中藥含量測定方法研究［6-8］，但還未見有將此方法應用于女貞子的含量測定中。本文報道采用此技術進行女貞子藥材樣品的前處理，結合反相高效液相色譜法，消除了樣品中雜質對齊墩果酸、熊果酸在紫外末端測定的干擾，使樣品中齊墩果酸與熊果酸在同一色譜條件下較好地得到了分離，并進行了多批次樣品的含量比較，以期為女貞子藥材的質量評價提供更穩定可靠的方法。

1儀器與試藥

HP1100Series高效液相色譜儀（美國Agilent），二極管陣列檢測器及HPChemStation4.0色譜工作站；Millipore純凈水發生器（MilliporeCo.Ltd.,USA）；SUPELCLEAN固相萃取小柱（500mg/3mL，美國SUPELCO公司）。

齊墩果酸（oleanolicacid）、熊果酸（urosolicacid）對照品及女貞子對照藥材（批號1041－9701）購自中國藥品生物制品檢定所，女貞子藥材測試品來源見表1。液相色譜純試劑為Merck公司產品，其余試劑均為國產分析純。

表1女貞子藥材樣品來源（略）

Tab.1SamplesofFructusligutriclucidi

2方法與結果

2.1色譜條件與系統適用性

以KromasilKR1005C18（4.6mm×250mm，5μm）為色譜柱；以［乙腈甲醇（體積比1∶1）水（體積比90∶10）］為流動相；流速為0.8mL/min；柱溫為25℃；檢測波長為210nm；進樣量為5μL。理論塔板數按齊墩果酸峰計算應不低于5000，按熊果酸峰計算應不低于4000，二者的分離度為1.47，齊墩果酸的拖尾因子為1.02，熊果酸的拖尾因子為0.99。對照品和樣品的色譜圖見圖1。

圖1對照品（A）及女貞子藥材（B）HPLC色譜圖（略）

Fig.1HPLCchromatogramsofreferencesubstances（A）andsampleofFructusligutriclucidi

2.2對照品溶液制備

精密稱取齊墩果酸、熊果酸對照品適量，加甲醇溶解并定容，分別制成質量濃度為216μg/mL，120μg/mL的溶液，備用。精密吸取上述對照品溶液各1mL，置2mL量瓶中，充分混和，制成對照品混合溶液，備用。

2.3線性關系考察

分別精密吸取上述對照品混合溶液1、2、4、6、8、10、20、30μL，按“2.1”項色譜條件進樣測定，以峰面積（A）對照品質量（m）進行線性回歸，回歸方程分別為：齊墩果酸A=0.5954m+6.0525，r=0.9999，線性范圍0.108～3.24μg；熊果酸A=0.7213m+2.7388，r=0.9999，線性范圍：0.060～1.800μg。

2.4供試品溶液制備

取女貞子藥材粉末約1.0g，精密稱定，加三氯甲烷20mL，稱重，水浴回流提取2次，每次0.5h，冷卻后稱重，加溶劑補足重量，濾過，合并濾液，水浴蒸干溶劑，殘渣以三氯甲烷5mL溶解，加于固相萃取小柱上，收集洗脫液于10mL量瓶中，繼續加4mL洗脫，合并至量瓶中，加三氯甲烷至刻度，用0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.5穩定性試驗

精密吸取對照品混合溶液5μL，分別于0、1、2、4、8、12、24h測定，結果齊墩果酸、熊果酸的平均峰面積分別為776.4、248.5，RSD分別為1.22％、1.43％。

2.6精密度試驗

精密吸取對照品混合溶液5μL，重復進樣6次，結果齊墩果酸、熊果酸的平均峰面積分別為767.9、246.4，RSD分別為0.72％、1.09％。

2.7重復性試驗

取同一批次供試品9份，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，吸取2μL進樣，進行測定，結果齊墩果酸、熊果酸的平均質量分數分別為0.93％（n=9）、0.25％（n=9），RSD分別為1.51％、2.56％。

2.8回收率試驗

取6份同一已知齊墩果酸和熊果酸含量的女貞子藥材0.5g,精密稱定，分別準確加入齊墩果酸、熊果酸對照品各適量，余同“2.4”項下操作，進樣2μL，測定峰面積，計算回收率，結果齊墩果酸、熊果酸的平均回收率及RSD分別為100.50%、98.05%和2.36%、2.6%，見表2、3。

2.9樣品含量測定

取11批樣品各1g，依法制成供試品溶液，精密吸取2μL，依選定的色譜條件進樣測定，計算含量，結果見表4。

表2齊墩果酸加樣回收率試驗（略）

Tab.2Recoveryresultsofoleanolicacid

表3熊果酸加樣回收率試驗（略）

Tab.3Recoveryresultsofursolicacid

表4女貞子藥材齊墩果酸、熊果酸含量測定結果（略）

Tab.4Determinationresultsofoleanolicacidandursolicacid

3討論

3.1三萜類成分為女貞子中的主要成分，齊墩果酸為其中的代表性成分。本文采用硅膠作為固相萃取的填料，能夠有效吸附女貞子提取液中的雜質，從而保證了樣品在210nm下受到的干擾最小。

3.2供試品制備過程中，SPE小柱洗脫后收集三氯甲烷溶液蒸干，殘渣若用甲醇溶解，結果殘渣不能完全溶解，可能是由于三氯甲烷洗脫液中包含有少量不溶于甲醇的非極性物質；而且齊墩果酸、熊果酸含量比本文采用的樣品處理方法的含量低約11%。而對照品加甲醇，則能夠完全溶解。表明樣品中的非極性雜質在用甲醇溶解時，由于其不溶于甲醇而包裹了部分齊墩果酸、熊果酸從而導致含量降低。另外，若用甲醇洗脫，由于甲醇的洗脫能力太強，將雜質一并洗脫，不能使SPE起到凈化樣品的作用。采用三氯甲烷洗脫既能有效洗脫齊墩果酸、熊果酸，又能減少雜質的干擾，因此最終決定采用三氯甲烷作為樣品溶劑。

3.3SPE小柱有100mg/3mL、500mg/3mL等不同的規格，在試驗過程中發現100mg/3mL小柱不能完全吸附齊墩果酸和熊果酸，導致回收率偏低。而500mg/3mL則能夠完全吸附。因此，在采用SPE方法進行樣品前處理時，應考慮SPE小柱的吸附容量大小對含量測定的影響。

3.4從測定的11批結果看，不同來源的女貞子藥材中齊墩果酸差異為2.1倍；熊果酸的差異為2.2倍。表明不同來源的女貞子藥材中二者的含量有一定的差異。

【參考文獻】

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