豬鏈球菌分離和鑒定
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2000年4月，陜西省岐山縣種豬繁育場仔豬流行關節炎和敗血癥。無菌采取患關節炎豬的關節液和患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結各8份病料，并對這16份病料進行病原菌分離試驗、血清學鑒定、致病力試驗、保護力試驗、細菌回收試驗、藥敏試驗。結果表明：該病原菌為2型豬鏈球菌，引起關節炎的豬鏈球菌較引起敗血癥的豬鏈球菌致病力弱；該菌對頭孢菌素、青霉素高度敏感。
論文完成日期：2000年6月15日
目錄
摘要………………………………………………1
前言………………………………………………2
1.試驗材料……………………………………….2
2.方法…………………………………………….2
2.1病原分離……………………………………..2
2.2分離菌株的鑒定……………………………..2
2.3致病力及保護力試驗………………………..3
2.4藥敏試驗……………………………………..3
3.結果…………………………………………….4
3.1分離菌的培養特性及形態特征….………….4
3.2生化試驗結果………………………………..5
3.3血清學鑒定結果……………………………..5
3.4致病力試驗及保護力試驗結果……………..5
3.5細菌回收試驗結果…………………………..5
3.6藥敏試驗結果………………………………..5
4分析與討論…………………………………….6
參考文獻…………………………………………7
豬鏈球菌的分離與鑒定
摘要
2000年4月，陜西省岐山縣種豬繁育場仔豬流行關節炎和敗血癥。無菌采取患關節炎豬的關節液和患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結各8份病料，并對這16份病料進行病原菌分離試驗、血清學鑒定、致病力試驗、保護力試驗、細菌回收試驗、藥敏試驗。結果表明：該病原菌為2型豬鏈球菌，引起關節炎的豬鏈球菌較引起敗血癥的豬鏈球菌致病力弱；該菌對頭孢菌素、青霉素高度敏感。
關鍵詞：豬鏈球菌分離鑒定
前言
豬鏈球菌（Streptococcosissuis）是豬的一種重要疾病，養豬業發達國家如美、英、荷及愛爾蘭等常有本病發生。我國于1958年就有豬鏈球菌病的報道，1976年我國南方幾省曾一度廣泛流行，給我國養豬業帶來了很大危害。
豬鏈球菌截止到目前已發現的莢膜型已超過30種[1]。我國于1995年首例鑒定證實2型豬鏈球菌在我國的存在[2]。豬鏈球菌可致2—6周齡仔豬敗血癥、腦膜炎、關節炎及支氣管肺炎等[3-7]。病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源，病豬的鼻液、尿液、血液、肌肉、內臟和關節內均可檢出病原體。未經無害處理的病死豬肉、內臟及廢棄物是散播本病的重要原因，呼吸道是本病的主要傳播途徑。本病一年四季均可發生，但以4—10月份發生較多。本病常為地方性流行性，多呈敗血性。短期波及全群，如不進行防治，則發病率、病死率很高，慢性常為地方性散發性傳染。
2000年4月，岐山縣種豬繁育場仔豬流行關節炎及敗血癥，多為2—6周齡仔豬。無菌采取關節炎病豬的關節液及敗血癥病豬的肝、脾、肺及腸系膜淋巴結，經實驗室分離鑒定，證實為2型豬鏈球菌。現將分離鑒定結果報告如下。
1．實驗材料
1．1病料無菌采取岐山縣種豬繁育場患關節炎病豬的關節液8份，編號為1—8號，無菌采取患敗血癥豬的肝、肺、脾及腸系膜淋巴結8份，編號為9—16號。
1．2試劑試驗所用的各種糖均購自上海化學試劑二廠，批號自95—98年不等。
1．3培養基綿羊鮮血平板、匹克氏增菌液、10ml/L豬血清肉湯及各種糖培養基按常規方法制備[8]。
1．4血清學試驗豬鏈球菌診斷血清與平板凝集抗原均購自中國獸藥鑒察所，批號為990705。
1．5藥敏紙片購自浙江省軍區后勤部，批號20000312。
1．6試驗動物健康小白鼠（30—35g）50只，購自第四軍醫大學實驗動物中心。
2．方法
2．1病原分離
將所采病料分別涂片，革蘭氏染色鏡檢，然后，分別接種鮮血瓊脂平板。37℃需氧培養24h后，挑取可疑菌落接種于匹克氏增菌液，37℃培養24h后，革蘭氏染色，顯微鏡檢查，再接種血清肉湯，純化后放置4℃，冷藏備用。
2．2分離菌株的鑒定
2．2．1生化試驗
隨機抽取上述分離菌血清肉湯培養物3#、8#、13#、15#，分別接種于蔗糖、山梨醇、棉實糖、葡萄糖、甘露糖、蕈糖、乳糖、菊糖、水楊苷、馬尿酸鈉培養基，37℃培養24h后，觀察其對糖的利用情況。2．2．2血清學鑒定
將3#、8#、13#、15#菌經緩沖肉湯培養8h，通過3000r/min離心10min，PBS洗滌2次，用Ph7.2的0.01mol/LPBS制成1*1010~2*1010細菌懸液。取1滴上述細菌懸液與適當的抗血清在潔凈玻片上混勻，立即觀察凝集現象。同時，設立細菌懸液對照及血清對照。
2．3致病力及保護力試驗
2．3．1菌落形成單位的測定按常規方法進行[9]
2．3．2致病力試驗
無菌吸取上述血清肉湯培養物（含菌量5.0*108CFU/ml）以0.1ml/只、0.2ml/只、0.3ml/只、0.4ml/只、0.5ml/只分別腹腔注射小白鼠2只，觀察其死亡時間和數量，測定其最小致死量。再將上述血清肉湯培養物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7組。第一組，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二組每只注射8#菌0.2ml，第三組每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四組每只注射13#菌0.2ml，第五組每只注射15#菌0.2ml，第六組每只注射13#、15#菌各0.1ml，第七組每只注射無菌血清肉湯1.0ml。以上各組分別飼養觀察其死亡時間及數量。
2．3．3保護力試驗
將3#、8#、13#、15#血清肉湯培養物分別接種于18cm鮮血平板。37℃培養24h后，收菌，用麥氏比濁管比濁，適當稀釋，然后用0.3%甲醛滅活；37℃作用24h；作無菌檢驗。然后分別腹部皮下接種小白鼠2只，0.4ml/只。10天后，再分別人工感染，0.2ml/只。
2．3．4細菌回收試驗
對致病力試驗出現癥狀及死亡小白鼠剖檢，并采集病料，進行分離。
2．4藥敏試驗
采用紙片擴散法，用無菌棉簽蘸取分離菌的血清肉湯培養物，均勻涂布于9cm鮮血平板；待稍干后，用無菌鑷子將各種藥敏紙片分別平貼在培養基表面，4℃2h使藥物擴散，然后置37℃培養20—24h，觀察結果。結果按抑菌圈直徑大小和各抗菌藥的具體標準，評定為高度敏感、中度敏感或耐藥。結果評定參照表1。
表1各種抗菌藥物的抑菌圈與敏感標準
抗菌藥物名稱
抑菌圈直徑（mm）
耐藥
中度敏感
高度敏感
青霉素
土霉素
潔霉素
鏈霉素
慶大霉素
卡那霉素
頭孢菌素
<10
<10
<10
<10
<12
<12
<10
10~12
10~14
10~14
10~14
13~14
13~14
10~15
>13
>15
>15
>15
>15
>15
>15
3．結果
3．1分離細菌的培養特性及形態特征
3．1．1培養特性
37℃培養24h后，所采的12份病料在鮮血瓊脂平板上形成表面光滑、隆起的灰綠色小菌落，外層有明顯的β溶血環。該菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉湯中先均勻渾濁，后在試管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。
3．1．2染色特性
關節液、鮮血瓊脂、匹克氏增菌液及血清肉湯培養物涂片、革蘭氏染色、顯微鏡檢查為革蘭氏陽性，在關節液、鮮血瓊脂培養物中多呈單個、雙球或短鏈狀排列，在匹克氏增菌液及血清肉湯培養物中多呈長鏈狀。
3．2生化試驗結果（見表2）
表2分離菌生化試驗結果
鑒定蔗糖山梨棉實葡萄甘露蕈糖乳糖菊糖水楊馬尿
項目醇糖糖糖苷酸鈉
3#+--++++++-
8#+--++++++-
13#+--++++++-
15#+--++++++-
判定標準：“+”表示大多數（90%—100%）菌株為陽性；“-”表示大多數（90%—100%）菌株為陰性。
表2表明分離的3#、8#、13#、15#菌的生化反應結果均符合豬鏈球菌的生化特性，說明分離的菌均為豬鏈球菌。
3．3血清學鑒定結果
將3#、8#、13#、15#細菌懸液與1/2及2型抗血清混合，立即可見明顯的凝集現象，但不與1型及其他型抗血清出現凝集。直接挑取細菌菌落與血清混勻，也能得到一致結果。陰性對照均未見凝集現象。
3．4致病力試驗結果及保護力試驗結果
3．4．1致病力試驗結果
第一組、第二組小白鼠注射血清肉湯培養物48h內均未見死亡，第三組48h內有一只死亡，第四組、第五組、第六組在注射血清肉湯培養物18h內全部死亡。死亡后，小白鼠皮膚發紺，剖檢肝、脾、肺、心出血，呈敗血癥。第七組健活。由于第一、二、三組死亡數量非常少，所以，再用相同劑量分別背部皮下接種小白鼠各2只，48h后處死，剖檢發現注射部位有直徑0.9~1.1cm的膿腫，濃汁呈黃綠色。3．4．2保護力試驗結果免疫的小白鼠再經攻毒后均未發病。
3．5細菌回收試驗結果
將上述死亡及發病的小白鼠剖檢采集病料，進行細菌分離、生化試驗及血清學鑒定，能得到原分離菌。
3．6藥敏試驗結果（見表3）
表3藥敏試驗結果
菌號
抑菌環直徑（mm）
頭孢菌素青霉素潔霉素卡那霉素土霉素鏈霉素慶大霉素
3#19151413877
8#18161313867
13#19161413778
15#19151314888
平均值18.7515.513.513.257.757.07.5
表3表明，結果敏感的藥物依次是：頭孢菌素、青霉素；中度敏感的依次是：潔霉素和卡那霉素；而對土霉素、鏈霉素、慶大霉素具有抗藥性。
4．分析與討論
4．1豬鏈球菌（Streptoccussuts）是危害養豬業的一種重要病原菌。80年代初，加拿大由豬鏈球菌引起的疾病開始增加。那時僅檢出9種夾膜血清型，其中2型是最常見的。
4．2豬鏈球菌病在臨床上有敗血型、腦膜腦炎型、關節炎型支氣管炎型等。過去屢有敗血型豬鏈球菌的報道，而關于集約化養豬場關節炎型鏈球菌病的報道較少。本次試驗從患關節炎豬的關節液中成功的分離出了豬鏈球菌。另外，岐山種豬場，約有60%的仔豬流行關節炎，嚴重者可發生敗血癥而死亡，給種豬場造成巨大的經濟損失。所以，研究本病可為生產中防制本病提供理論依據。
4．3病豬和帶菌豬是本病的重要傳染源。病豬的鼻液、尿液、肌肉、內臟和關節內均帶有病原體，所以，我們建議，首先應加強對健康豬的免疫。另一方面，在發病后，加強病豬和健康豬的隔離，根據實驗室所做的藥敏試驗結果，配合藥物治療，建議用頭孢菌素、青霉素、潔霉素等藥物治療。岐山縣種豬繁育場采納我們的建議后，首先對所有的未發病仔豬用滅活疫苗免疫接種，對已發病的豬用青霉素等藥物配合治療。另外，注意衛生管理。目前該病已得到有效的控制。
4．4從致病力試驗結果可以看出，引起豬關節炎的豬鏈球菌的致病力較小，而引起敗血癥的豬鏈球菌的致病力較強。但通過生化試驗和血清學鑒定，它們又是同種細菌且血清型也相同。為什么同種血清型的豬鏈球菌的致病力差別很大？這個問題還有待于進一步研究。
參考文獻
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