探討轉錄基因的克隆方法

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1序列分析

采用VectorNTI11.0進行多序列比對?；跀M南芥、水稻、毛果楊、小立碗蘚、番茄衣藻(的SPL蛋白中SBP-domain區氨基酸序列(76aa)，采用MEGA4.0軟件(鄰接法)進行多序列比較，對光皮樺BlSPL1進行系統進化分析(Tamuraetal．，2007)，所用序列來自數據庫。具體的基因名和序列號參考Salinas等(2011)的報道。按照試劑盒說明進行，其擴增反應程序為:95℃5min;95℃5s，60℃20s，72℃20s，40個循環。定量引物為51QF和51QR，內參基因Actin的引物為，采用相對定量分析基因表達。SNP分析鑒于BlSPL1基因組序列較長，為便于克隆和測序，將其分成A和B2段進行克隆、SNP搜尋與分析，其中段包含5''''-UTR部分序列和第1、2個外顯子及第1個內含子、第2個內含子部分序列共1665bp，B片段包括第2個內含子部分序列、第3個外顯子(含miR156靶位點)以及3''''-UTR共846bp。引物51F433和51R2098用于段的克隆，51F2608和51R用于B片段的克隆。以57個不同種源的無性系植株基因組DNA為模板，采用高保真Pfu酶(北京全式金)進行PCR擴增，PCR擴增產物回收后采用pEASY-BluntcloningKit進行克隆，挑取陽性克隆進行序列測定，每個樣本至少挑3個克隆進行測序。利用DnaSP5.0軟件(Libradoetal．，2009)對序列進行分析，搜尋SNP位點、計算SNP頻率及多樣性指數;分析同義突變、錯義突變和無義突變情況;分析LD在光皮樺不同群體BlSPL1基因中的延伸模式。

2結果與分析

2.1光皮樺BlSPL1基因的克隆及其序列分析

基于光皮樺轉錄組序列，利用RACE技術，克隆獲得了BlSPL1基因。序列分析結果表明，該基因cDNA序列全長1825bp，分別包含486bp的5''''-UTR，169bp的3''''-UTR，以及長為1170bp開放閱讀框，其編碼389個氨基酸。用ProtParamtool估算推導的蛋白質的分子量約為42.37kDa，其等電點為8.43。同源分析表明，與桃、蘋果(Malus×domestica)MdSPL1(ADL36824.1)的序列同源性最高，分別達到67%和60%。同時，為進行后續的SNP分析，根據cDNA序列克隆了其對應的基因組DNA序列。結果表明BlSPL1的基因組序列全長3457bp，包含2個內含子和3個外顯子，第1個內含子長1005bp，第2個內含子為624bp，3個外顯子分別長416bp，134bp，620bp，在第3個外顯子處含有miR156靶位點。進一步的蛋白結構域分析表明，BlSPL1在蛋白質的第92—170氨基酸殘基位置上含有該基因家族所特有SBP結構域，此結構域包含2個鋅指結構，其中N端鋅指結構(Zn-1)為Cys3His，C端鋅指結構，另外在該結構域的C端第150—167位置上含有核定位信號，這與相關報道相符。為分析BlSPL1基因的系統進化關系，參照Salinas等(2011)構建了SBP-box基因家族系統發育進化樹。可見，陸地植物SPL蛋白分化為8個分支，即groupⅠ－Ⅷ，而BlSPL1屬于groupⅦ這一分支，與來自水稻、擬南芥和楊樹的相關SPL蛋白同屬一個分支，且與楊樹的PtSBP20親緣關系最近。BlSPL1基因的表達分析SPL基因在植物成花過程中被認為是比較上游的調控因。因此，本研究采用定量PCR對BlSPL1基因在光皮樺芽、雌花、雄花以及幼苗早期不同發育階段的表達情況進行了分析?？梢?，BlSPL1基因在光皮樺的芽、雌花、雄花、幼苗中均有表達，但在雄花和幼苗中的表達水平較低，而在芽發育成雌花的過程中其表達逐漸升高B1－B3)，在雌花明顯可見時(F1)表達量達到最高，其后表達量又逐漸降低。從這些結果可以初步推測BlSPL1可能在芽發育為雌花的過程中起調控作用。

2.2BlSPL1基因SNP多樣性分析

插入和缺失長度在1～3bp之間，其中編碼區有一長度為3bp的插入，未導致編碼區的移碼突變，其余均發生在非編碼區。BlSPL1基因內SNP發生的平均頻率為1/26bp，在5''''-UTR、外顯子、內含子、3''''-UTR分別檢測到了2、28、61、7個SNPs，其出現頻率為內含子＞3''''-UTR＞5''''-UTR＞外顯子。由SNP在BlSPL1基因內部出現的頻率可知，該基因不同區域的保守性不同，而在編碼區核苷酸變異程度最低，顯示了該基因在進化過程中編碼區受到了較強的選擇壓。進一步對檢測到的97個SNPs進行了變異類型統計(表3)。結果顯示，在這些SNPs中，有57個屬于轉換類型，分別包含29個AG和28個TC。對于顛換類型，共檢測到40個，分別是14個AC、7個TG、11個AT和8個GC，轉換/顛換=1.43。為檢測BlSPL1編碼區SNPs是否引起其編碼氨基酸的改變，對編碼區內的28個SNPs進行了同義突變、錯義突變、無義突變分析。在BlSPL1編碼區內的28個SNPs中，11個屬于同義突變，17個為錯義突變。其在SBPdomain區域內發生了2次同義突變和0次錯義突變，而在SBPdomain外的編碼區發生了9次同義突變和17次錯義突變，如位于編碼區的第172和第1974位置上分別發生了第1位和第2位密碼子的改變，由AGA突變為GGA，GCA突變為GAA，從而分別導致其編碼的氨基酸由精氨酸(Arg)變成甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)變成谷氨酸(Glu)。可知SBPdomain編碼區內無錯義突變，而SBPdomain以外編碼區錯義突變頻率為1/18aa;又基因的第3個外顯子內錯義突變達15個，而其區域內的miR156靶位點沒有核苷酸突變位點出現。由以上可知SBPdomain和miR156靶位點有很強的保守性。BlSPL1基因在光皮樺不同群體內的遺傳分化及變異為了檢測BlSPL1基因在光皮樺不同群體內核苷酸變異及群體分化程度，利用DnaSP5.0軟件對5個群體分別進行了多態性位點數、單核苷酸多樣性、的中性檢驗。對于檢測到的SNP多樣性指數πtot、πsil、πs、πn均有差異，但差異不顯著，說明BlSPL1在群體間的分化程度并未達到顯著水平。Tajima’sD*和FuandLi’sD*中性檢驗結果表明，D*均為負值，這顯示了在光皮樺群體內，BlSPL1基因在進化過程中存在過剩的稀有SNPs，特別是廣西群體內存在較多的低頻率SNPs。而5個群體，均為πn＜πs，即非同義突變與同義突變的比率＜1，顯示出在光皮樺物種演化過程中，純化選擇是BlSPL1基因內同義SNP位點的主要篩選壓。

2.3BlSPL1基因內SNPs的連鎖不平衡分析

SNPs的LD程度迅速削弱，但不同群體內LD衰退程度明顯不同;當R2＜0.1，在黃山東部、武夷山東部、廣西、四川、貴州群體中LD衰退序列長度分別達到，其中來自四川的群體LD在該基因組延伸長度最短。這一結果表明，在光皮樺不同天然群體內，BlSPL1基因內SNPs存在不同程度的連鎖不平衡，但其連鎖不平衡在候選基因內就已衰退。

3討論

序列分析表明在其第3個外顯子處含有miR156靶位點，同時其編碼的氨基酸具有典型的SBP-domain，包含2個典型的鋅指結構。進一步的系統進化分析表明BlSPL1屬于陸地植物SPL蛋白groupⅦ這一分支，且與楊樹的PtSBP20、擬南芥AtSPL13等具有較近的親緣關系，基因組序列分析結果也顯示BlSPL1的基因結構與這一分支的同源基因相似，因此這些基因在功能上可能有一定的相似性，但目前這一分支的基因并沒有深入的功能研究。同時，系統進化分析顯示在每個SPL蛋白分支中都包含至少一個單子葉和雙子葉植物的SPL基因(groupⅣ除外)，這表明BlSPL1與其他高等植物的SPL基因可能具有共同的祖先，而在groupⅦ分支中，BlSPL1與同為林木的楊樹SPL基因親緣關系最近，反映了光皮樺與楊樹間的親緣關系，同時也表明隨著雙子葉植物的分化，其相應的SPL基因可能也在進一步的特化。雖然SPL基因在植物中參與不同的生長發育調控，但目前對功能的研究主要集中于其對開花過程的調控。在模式植物擬南芥中的研究說明，miR156-SPL3是調控植物成花的重要途徑。但在林木中，SPL基因的功能和調控機制仍然不明確。由于缺乏可用轉基因平臺或突變體，目前對木本植物SPL基因功能的研究大多是通過表達分析來進行研究。如對枳的SPL9和SPL13進行了表達分析，發現兩者在葉、莖、根、花、果等各個器官均有表達，分別在莖和幼果中表達量最高，推測它們可能分別與莖和果實的發育相關(宋長年等，2010)。BlSPL1基因的表達也具有組成性，在幼苗、芽、雄花和雌花均有表達，在雄花和幼苗中表達水平較低，但在芽發育成雌花的過程中有一個明顯的表達水平上調，這些結果暗示BlSPL1與光皮樺的開花相關，且可能在雌花發育過程中起調控作用。

作者：李玉嶺周厚君林二培黃華宏徐莉莉童再康單位：浙江農林大學