誘導多潛能干細胞技術論文

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1iPSC技術

經(jīng)典的iPSC技術路線主要包括以下步驟:①選擇宿主細胞;②選擇外源重組因子;③重組因子導入宿主細胞;④重編程產(chǎn)生iPSC;⑤iPSC的鑒定及分化。

1．1宿主細胞來源Yamanaka將小鼠體細胞誘導為iPSC開啟了該技術的先河，之后人、大鼠、猴、豬、綿羊，甚至一些瀕危動物的iPSC系紛紛建立。就人類而言，目前已從皮膚成纖維細胞、角質(zhì)成形細胞、羊水、神經(jīng)前體細胞、外周血細胞，甚至尿液中獲得iPSC。不同組織來源細胞重編程效率及所需因子不同。不僅iPSC分化能力因人而異，在表觀遺傳穩(wěn)定性和癌基因的表達方面也存在男女有別現(xiàn)象。使得iPSC技術應用于臨床個體治療更具挑戰(zhàn)性。

1．2重組因子的選擇及導入方式經(jīng)典的Yamanaka因子在癌細胞中存在超表達、整合型載體可導致插入突變，且誘導效率非常低。因此，iPSC研究者一直致力于尋求更安全、簡單、有效的誘導策略。Anokye-Danso等應用微RNA調(diào)控技術，不使用轉錄因子高效誘導iPSC。Zhou等和Kim等分別利用Yamanaka四因子的融合蛋白和穿膜肽與轉錄因子蛋白的融合蛋白，直接誘導受體細胞為iPSC，但效率較低。一些學者利用腺病毒、質(zhì)粒載體瞬時轉染靶細胞，或利用Cre/LoxP系統(tǒng)、oriP/EBNAI系統(tǒng)及piggyBac轉座系統(tǒng)將外源基因整合后再特異性切除，從而得到不含外源基因整合的iPSC，但是存在基因重排及效率低下現(xiàn)象。而一些小分子化合物(如丙戊酸、曲古抑菌素A、維生素C、篩選激酶抑制劑、BIX-01294、5-AZA、Wnt3a、Zscan4因子)的應用可顯著提高iPSC的產(chǎn)生效率。

1．3iPSC的誘導分化Zhao等利用iPSC通過四倍體囊胚注射得到存活并具繁殖能力的小鼠，證明了iPSC的全能性。目前，人們已成功地將iPSC在體外定向誘導分化為神經(jīng)細胞、造血細胞、胰腺細胞、肝細胞、血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、耳蝸毛細胞、色素細胞等類型細胞。

1．4iPSC機制相關研究突破研究人員長期受困于體細胞重編程的具體機制。Polo等繪制出體細胞重編程為iPSC的分子線路圖，證實誘導過程引起了兩次轉錄波，分別是由c-myc/Klf4和Oct4/Sox2/Klf4驅動，并確定了重編程過程中路障基因。基于iPSC技術已證明細胞的分化過程并非不可逆轉，研究人員利用細胞直接重編程技術將已分化細胞直接轉化成特定譜系的細胞，利用間接譜系轉化技術部分去分化生成多潛能祖細胞，為干細胞研究開辟了新思路。

2臨床應用前景

iPSC因其分化全能性、體外易擴增、易于基因干擾或過表達等特性，在再生醫(yī)學、藥物研發(fā)評價、組織工程等領域有廣泛應用前景。

2．1疾病特異iPSC動物疾病模型由于種屬差異，不能真實反映人類疾病，利用疾病特異的iPSC系建立的iPSC疾病模型則可彌補這一缺陷，還可在免疫缺陷動物體內(nèi)觀察疾病。當前已建立包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病(帕金森病、亨廷頓病、肌萎縮側索硬化癥、脊髓性肌萎縮、唐氏綜合征、脆性X綜合征)，血液系統(tǒng)疾病(范科尼貧血、鐮刀細胞型貧血、β地中海貧血、原發(fā)性骨髓纖維化)，代謝系統(tǒng)疾病(1型糖尿病，Ⅲ型戈謝病，Shwachman-Bodian-Diamond綜合征、肌營養(yǎng)不良、萊施-奈恩綜合征)及其他疾病(右心室心肌病)等特異的iPSC系。

2．2藥物研發(fā)及篩選大規(guī)模藥物篩選需要很多細胞，iPSC可以無限增殖，并且疾病特異iPSC本身就是篩選藥物的目標。Takayama等導入Foxa2及肝細胞核因子1α到人類ESC/iPSC產(chǎn)生具有代謝功能的肝細胞樣細胞，對篩查藥物肝毒性具有重大意義。Lippmann等將iPSC轉化為血腦屏障的內(nèi)皮細胞，可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物高通量篩選或藥物神經(jīng)毒性檢測。Egawa等利用肌萎縮側索硬化癥患者iPSC分化而來的神經(jīng)細胞來篩選并確認藥物效果，發(fā)現(xiàn)漆樹酸具有改善神經(jīng)異常的作用。

2．3組織工程學應用用干細胞培養(yǎng)的人體組織是理想的器官再造來源。英國已經(jīng)報道利用3D打印技術為癌癥患者重塑面部，F(xiàn)aulkner-Jones等將3D打印拓展到人ESC范圍，當3D打印技術能夠兼容iPSC時，組織工程學將邁上一個新的臺階。

2．4臨床疾病治療

2．4．1神經(jīng)系統(tǒng)疾病帕金森病是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，目前治療手段只能改善癥狀。Kikuchi等利用iPSC分化出能產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)細胞，然后移植到帕金森病猴子腦部，這些細胞存活半年以上，并持續(xù)釋放多巴胺，很大程度上減輕了患病猴子的癥狀。Jiang等將帕金森病患者和健康志愿者皮膚細胞來源iPSC誘導為腦細胞并對比，觀察到parkin基因發(fā)生突變產(chǎn)生自由基破壞多巴胺神經(jīng)元是帕金森病發(fā)病機制之一。除帕金森病外，在阿爾茨海默病、脊髓側索硬化癥、脊髓肌肉萎縮癥及舞蹈癥等神經(jīng)退行性疾病研究中，iPSC也取得許多進展。

2．4．2血液系統(tǒng)疾病Hanna等將人類鐮刀型貧血癥小鼠皮膚成纖維細胞建立的iPSC，通過同源重組技術獲得正常基因型iPSC，誘導為造血干細胞并移植后可治療動物模型的鐮狀細胞性貧血。Xu等用iPSC來源的內(nèi)皮前體細胞和內(nèi)皮細胞移植到血友病小鼠肝臟中，病鼠出血癥狀得到了改善。Raya等獲得了基因修飾后的貧血癥患者特異性iPSC，其能夠分化成表型正常的髓系和紅系造血祖細胞。最近，日本學者利用iPSC培養(yǎng)出一種能產(chǎn)生促紅細胞生成素的細胞，有望用于治療腎性貧血。

2．4．3心血管系統(tǒng)疾病2008年，Schenke-Layland等成功地將小鼠iPSC在體內(nèi)和體外分別誘導出了心肌細胞。之后，Nelson等將iPSC分化得到的心肌細胞移植入具有完整免疫系統(tǒng)的成年小鼠梗死心臟內(nèi)，能夠觀察到功能性的新生心肌。Tohyama等使用不含葡萄糖的低成本培養(yǎng)液獲得大量純度高達99%的心肌細胞，且?guī)缀醪淮嬖诎┗L險。而Zhang等證實iPSC具有分化為心房、心室和竇房結細胞等的潛能。

2．4．4感官疾病感音神經(jīng)性聾的主要原因是毛細胞及螺旋神經(jīng)節(jié)細胞退變和死亡，而其治愈需要相關結構的修復或再生。Nishimura等將iPSC來源神經(jīng)祖細胞移植到小鼠耳內(nèi)，觀察到這些神經(jīng)細胞開始表達谷氨酸神經(jīng)元的標志性因子，表明iPSC可用于螺旋神經(jīng)節(jié)損傷的再生修復。Oshima等使用小鼠ESC及iPSC成功分化出了功能性內(nèi)耳毛細胞。Mizutari等使用γ-分泌物抑制劑抑制Notch信號通路，刺激支持細胞轉變?yōu)槊毎状巫C明成熟哺乳動物的感音毛細胞也能再生。感音毛細胞的損傷導致聽力損失，感光細胞的損失則導致視力損失。Meyer等將iPSC分化為視網(wǎng)膜色素上皮細胞，成功治愈1例回旋狀脈絡膜視網(wǎng)膜萎縮癥患者。Singh等將發(fā)育中的感光細胞移植到盲鼠眼睛中，能夠再次形成視網(wǎng)膜的整個光敏感層，恢復視覺。

2．4．5內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病Tateishi等將正常人iPSC培養(yǎng)成胰島素分泌型的胰島細胞，其不僅能分泌C肽和胰高血糖素，而且能通過感受葡萄糖的刺激來調(diào)節(jié)C肽的分泌。Maehr等用1型糖尿病患者的成纖維細胞來源iPSC分化出了具有胰島素分泌功能的細胞。這些研究使糖尿病患者特異細胞治療成為可能。

2．4．6生殖系統(tǒng)疾病Park等將iPSC體外分化并分離得到原始生殖細胞，其與體內(nèi)分離的原始生殖細胞在基因表達上極相似。Hayashi等將小鼠ESC和iPSC在體外誘導成為原始生殖細胞樣細胞并分化為功能正常的精子和卵子。如果能進一步將人原始生殖細胞體外分化為精子和卵子，就有望治療不孕不育癥。

2．4．7運動系統(tǒng)疾病杜氏肌營養(yǎng)不良是一種X染色體隱性遺傳病，患者早期即出現(xiàn)肌肉無力或萎縮，嚴重威脅生命安全。Filareto等將杜氏肌營養(yǎng)不良小鼠皮膚細胞重編程為了iPSC，進行遺傳修復，再分化成骨骼肌干細胞進行移植治療，能產(chǎn)生功能性肌肉，并檢查到新形成的肌纖維表達修復后的標記，證明了iPSC技術結合遺傳修復技術治療杜氏肌營養(yǎng)不良的可行性。Diekman等利用iPSC在小鼠實驗中培育出無再生能力的軟骨，有望成為人造軟骨組織的來源。

2．4．8腫瘤Chen等用小鼠iPSC培育出了癌癥干細胞，并確認其發(fā)展成癌細胞的過程。Yang等發(fā)現(xiàn)人類iPSC來源的神經(jīng)干細胞可以靶向腫瘤，或可用于聯(lián)合基因治療，抑制腫瘤生長。Vizcardo等從惡性黑色素瘤患者體內(nèi)提取出T淋巴細胞，誘導出iPSC再分化成為T淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)這些T細胞能夠識別黑色素瘤特異性蛋白黑色素瘤抗原1，繼續(xù)攻擊癌細胞。此方法能夠大量培養(yǎng)T淋巴細胞，有望在此基礎上開發(fā)出治療癌癥的新型免疫療法。

2．4．9其他人類疾病CCR5(C-Cchemokinereceptortype5)是人類免疫缺陷病毒進入靶細胞的重要輔助受體，缺乏CCR5使人類免疫缺陷病毒不能感染人體。Yao等用鋅指核酸酶技術剔除患者iPSC的CCR5基因，并誘導成造血干細胞，為艾滋病的治療提供一條新的可能途徑。Arakaki等將小鼠iPSC與小鼠齒源性上皮細胞共培養(yǎng)，轉化為成釉細胞，且含有作為牙釉質(zhì)成分的成釉蛋白，這對牙齒再生和修復研究至關重要。

3展望

iPSC技術應用于臨床前必須確保其安全性。目前存在的主要問題:iPSC帶有自身表觀遺傳印記和端粒異常;與ESC相比存在少量基因異常表達;誘導本身及傳代過程都可導致變異。而且自體iPSC移植回患者機體后會否引起免疫反應一直存在著爭議。雖然存在各種疑惑和爭論，但iPSC技術潛力不可限量，隨著iPSC機制研究的進展，許多問題將迎刃而解，種種困難并不能減退人們對iPSC技術的研究熱情，iPSC技術必將勢不可擋地推動醫(yī)學的發(fā)展。

作者：馮睡安廣宇尹金淑單位：北京大學第九臨床學院首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院腫瘤科首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院耳鼻咽喉科