氨基酸菌劑制備與其在卷煙的運用

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本文作者：胡延奇作者單位：山東中煙工業(yè)有限責任公司

L-瓜氨酸（L-citrulline）又名氨基甲酰尿氨酸，一種非蛋白氨基酸。1914年右賀太郎從西瓜榨汁中首先分離得到，此后學者發(fā)現(xiàn)其為一種氨基酸，故將其命名為瓜氨酸。瓜氨酸以游離態(tài)存在于多種生物體內[1]，在動物體內瓜氨酸參與尿素循環(huán)（Krebs-Henseleit），起到氨解毒的作用，可用于保護肝臟。研究發(fā)現(xiàn)瓜氨酸在人體內還可以起到血管舒張[2]、診斷類風濕關節(jié)炎[3]、促進男子性功能等多種生理功能。同時，瓜氨酸具有清除羥基的功能[4]，在分子生物學試驗中被用作DNA和酶的保護劑[5]。此外，瓜氨酸作為抗氧化劑還常用于化妝品及食品等領域。瓜氨酸因其多種保健功能成為了近年來國內外學者關注的熱點。瓜氨酸的制備方法主要有：化學法、提取法、發(fā)酵法[6]、酶法[7-11]等。化學法合成瓜氨酸，產(chǎn)物回收率較低，產(chǎn)品多為DL-型外消旋體，分離困難，并且操作中引入了有機試劑，存在著潛在的健康威脅。提取法主要從生物體內提取瓜氨酸，成本高，工藝繁瑣，不利于工業(yè)化。發(fā)酵法多為從自然界中篩選出可高產(chǎn)瓜氨酸的菌株進行發(fā)酵生產(chǎn)。發(fā)酵法生產(chǎn)瓜氨酸成本低，產(chǎn)量高，但是微生物代謝中，瓜氨酸作為中間產(chǎn)物存在，發(fā)酵液中可能含有精氨酸、鳥氨酸等多種氨基酸以及培養(yǎng)基成份，不利于后期分離純化。酶法是以精氨酸脫亞氨基酶為催化劑，催化L-精氨酸生產(chǎn)L-瓜氨酸。應用工程菌進行精氨酸脫亞氨基酶的生物合成，生產(chǎn)周期短，積累量大，隨后可進行生物轉化生產(chǎn)瓜氨酸，體系內雜質種類少、催化效率高、催化專一性強。擬通過對L-瓜氨酸的工程菌（帶有精氨酸脫亞氨基酶基因）生產(chǎn)技術及其在卷煙中的應用研究。以期為L-瓜氨酸的制備及其應用提供新思路。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌種

本單位構建的基因工程菌，以帶有精氨酸脫亞氨基酶基因的pET-22b(+)為載體，E.coliBL21(DE3)為宿主。1.1.2主要試劑L-瓜氨酸，Sigma公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG，胰蛋白胨、酵母抽提物、氨芐青霉素（Amp），均購自上海生工；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。1.1.3培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基LB（g/L）：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，pH為7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖，胰蛋白胨，氯化鈉，MgSO4•7H2O，K2HPO4•3H2O，pH7.0。滅完菌后加入50mg/L的氨芐青霉素（Amp）。

1.2試驗方法

1.2.1培養(yǎng)及誘導方法

挑取單菌落于3.5mL液體LB培養(yǎng)基（含Amp）中培養(yǎng)過夜。按2%（v/v）的接種量接種于50mL發(fā)酵培養(yǎng)基（含Amp），37℃、200r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8時加入誘導劑IPTG0.1mM，28℃誘導5h。

1.2.2細胞轉化法測定酶活

將培養(yǎng)完后的菌液離心（2000g，10min）收集菌體，用0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）充分洗滌，再離心得到菌體。將菌體加入到pH6.0磷酸鹽緩沖液中（將20mL發(fā)酵液離心所得菌體加入到20mL細胞轉化反應體系中，底物精氨酸濃度為50g/L），40℃、180r/min反應，反應完后離心過濾測定上清中瓜氨酸的含量。

1.2.3細胞轉化法制備瓜氨酸的研究

1.2.3.1pH對瓜氨酸合成的影響

分別配置200mmol/L的HAC-NaAC（pH4.0，5.0）、KH2PO4-NaOH（pH=6.0，7.0）、Tris-HCl（pH8.0）緩沖液。采用20mL反應體系，50g/L的底物精氨酸，20g/L菌體，40℃，180r/min水浴振蕩反應5h后立即加熱煮沸終止反應，測定產(chǎn)物含量。

1.2.3.2溫度對瓜氨酸合成的影響

最適溫度：采用20mL反應體系，50g/L的底物精氨酸，20g/L菌體，對pH10的緩沖體系，分別在溫度為20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃下，180r/min水浴振蕩反應5h后立即加熱煮沸終止反應，測定產(chǎn)物含量。

1.2.3.3底物濃度對瓜氨酸合成的影響

采用20mL反應體系，10~100g/L不同濃度的底物精氨酸，20g/L菌體，pH6.0，40℃，180r/min水浴振蕩反應5h后立即加熱煮沸終止反應，測定產(chǎn)物含量。1.2.3.4菌體生產(chǎn)能力指標采用20mL反應體系，50g/L的底物精氨酸，20g/L菌體，pH6.0，40℃，180r/min水浴振蕩反應；5h后離心回收菌體，同樣的反應體系反應6h；重復4次，每次反應時間相應增加1h。

1.2.4瓜氨酸的檢測方法

定性檢測：紙層析法，新華一號層析紙（杭州新華紙業(yè)，裁成30×20cm），將樣品點樣2μL，制成圓筒，垂直展開，展開相采用正丁醇:冰醋酸:水（60:15:25），內含0.4%的顯色劑茚三酮，展開結束后自然晾干溶劑，85℃顯色10min，顯色強度與標樣比較。定量檢測：高效液相測定法，采用分析儀器柱前衍生化定量測定氨基酸，采用ODSC18（Φ4.6×250mm），40℃分析，檢測波長338nm，氨基酸定量用外標法定量。

1.2.5卷煙樣品制備

按照卷煙國家標準GB506.4-1996，將上述制備的L-瓜氨酸用75%乙醇溶液溶解，以加香方式施加于某牌號卷煙空白葉組煙絲中；在溫度(22±1)℃、相對濕度60%±1%條件下平衡24h后，將煙絲卷制成煙支；再次平衡24h后，與空白煙一起進行評價。

2結果及討論

2.1培養(yǎng)基優(yōu)化

在單因素基礎上進行了正交優(yōu)化。

2.1.1碳源對瓜氨酸生成量的影響

以葡萄糖作為碳源，其它成分為（g/L）：胰蛋白胨20，MgSO4•7H2O1，K2HPO41，NaCl5，配制不同濃度碳源的培養(yǎng)基。經(jīng)過培養(yǎng)、誘導、離心收集細胞和細胞轉化反應后測定反應液中瓜氨酸的含量，結果如圖1。圖1表明，起始時隨著葡萄糖濃度的增加發(fā)酵液的酶活逐漸增加，此時葡萄糖為微生物的生長代謝提供碳源；當葡萄糖濃度到達5g/L時，單位發(fā)酵液的酶活最高；此后，隨著葡萄糖濃度的增加單位發(fā)酵液的酶活開始降低，原因可能是葡萄糖效應影響了微生物的生長代謝。

2.1.2氮源對瓜氨酸生成量的影響

以胰蛋白胨作為氮源，其它成分為（g/L）：葡萄糖5，MgSO4•7H2O1，K2HPO41，NaCl5，配制不同濃度氮源的培養(yǎng)基。經(jīng)過培養(yǎng)、誘導、離心收集細胞和細胞轉化反應后測定反應液中瓜氨酸的含量，結果如圖2。胰蛋白胨可為微生物生長代謝提供豐富的營養(yǎng)，尤其是為蛋白質合成提供材料。由圖2看出，隨著胰蛋白胨濃度的增加，瓜氨酸生成量逐漸增加，當超過20g/L后瓜氨酸生成量的增加趨于平緩。

2.1.3發(fā)酵培養(yǎng)基的正交優(yōu)化

基于對碳源和氮源單因素研究的結果，選取葡萄糖，胰蛋白胨，MgSO4•7H2O，K2HPO4•3H2O作為研究因素，進行正交試驗設計。經(jīng)過培養(yǎng)、誘導、離心收集細胞和細胞轉化反應后測定反應液中瓜氨酸的含量，結果如表1所示。由正交試驗結果可以得到最佳的培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖5，胰蛋白胨20，K2HPO4•3H2O1，MgSO4•7H2O1，其中胰蛋白胨的影響最大，K2HPO4•3H2O次之。

2.2誘導條件優(yōu)化

pET質粒表達系統(tǒng)含有乳糖操縱子，進行目的基因表達需要乳糖或其結構類似物的誘導，IPTG作為乳糖的結構類似物在微生物代謝中不被利用，常被用作誘導劑。考慮到IPTG的毒性，研究了乳糖對工程菌誘導表達的影響。經(jīng)過培養(yǎng)、誘導、離心收集細胞和細胞轉化反應后測定反應液中瓜氨酸的質量濃度，結果如圖3。由圖3可知選取乳糖作為誘導劑對瓜氨酸的合成影響不大，完全可以替代IPTG。隨后選取加誘導劑時細胞OD值，誘導溫度，誘導時間，誘導劑量等作為研究因素，進行正交試驗設計。經(jīng)過培養(yǎng)、誘導、離心收集細胞和細胞轉化反應后測定反應液中瓜氨酸的含量，結果如表2所示。由結果可知最佳誘導條件為：OD值1.0，誘導溫度25℃，誘導時間7h，乳糖量5g/L，其中誘導時間影響最大，誘導溫度次之。

2.3細胞轉化體系研究

2.3.1pH對瓜氨酸產(chǎn)量的影響

考察了pH對瓜氨酸合成的影響，環(huán)境pH值會影響與酶的催化有關的氨基酸殘基的離子化狀態(tài)，影響影響酶的構象，影響底物與酶活性中心的結合。以底物轉化率最高的為100%相對轉化率作圖，結果如圖4所示，瓜氨酸合成的最佳pH為6.0。

2.3.2溫度對瓜氨酸合成的影響

考察了溫度對瓜氨酸合成的影響，如圖5所示，細胞轉化反應合成瓜氨酸的最適反應溫度是40℃。隨著溫度的升高，酶活性不斷增強，當溫度達到一定值后，酶活性開始下降，這是由于溫度升高到一定值后，酶開始變性，構象發(fā)生變化，影響了酶的活性。

2.3.3底物濃度對瓜氨酸合成的影響

對于菌體添加量為20g/L的體系，考察了底物濃度對細胞轉化反應的影響，如圖6所示，精氨酸質量濃度在60g/L以下時，底物轉化率均在90%以上；精氨酸濃度高于60g/L后，瓜氨酸的生成量的增加趨緩，分析原因可能是瓜氨酸作為精氨酸的結構類似物，會與精氨酸競爭結合精氨酸托亞氨基酶的活性中心，影響酶的催化效率，因此對于菌體添加量為20g/L的細胞反應體系，底物濃度應為60g/L。

2.3.4菌體生產(chǎn)能力指標

穩(wěn)定性和可重復性是酶重要指標，可為工業(yè)化應用提供依據(jù)。考察了工程菌的重復利用情況，對于菌體添加量為20g/L，精氨酸濃度為60g/L的體系，比較了不同批次細胞轉化反應的產(chǎn)物生成量。從圖7中可以看出工程菌重復使用3次，產(chǎn)物產(chǎn)量穩(wěn)定，第4次產(chǎn)量較降幅度較大，不再適合工業(yè)化生產(chǎn)。

2.4L-瓜氨酸在卷煙中的應用結果

將前述制備所得的L-瓜氨酸分別按0.01%，0.02%，0.04%，0.06%的用量按加香方式施加于某品牌卷煙混合絲；其結果分別如下表3所示。由表3可知，隨著L-瓜氨酸用量的增加，卷煙香氣量呈增加趨勢；但各香韻間的協(xié)調性略有降低，且不舒適的雜氣較重。對比評吸結果表明當其用量為0.02%時，綜合效果相對較好。

3結論

綜上所述，工程菌的最佳培養(yǎng)基為（g/L）：葡萄糖5，胰蛋白胨20，K2HPO4•3H2O1，MgSO4•7H2O1；最佳誘導條件為：OD值1.0，誘導溫度25℃，誘導時間7h，乳糖量5g/L；對于菌體濃度為20g/L的20mL細胞轉化反應體系，工程菌細胞生產(chǎn)瓜氨酸的最佳條件為：pH6.0，溫度40℃，精氨酸濃度為60g/L，產(chǎn)量達55.1g/L，細胞可連續(xù)使用三次，且產(chǎn)量穩(wěn)定，具有一定的工業(yè)應用價值。在卷煙中的應用初步研究結果表明：在卷煙生中，加入一定量的L-瓜氨酸可提升卷煙的香氣量、香氣質和改善余味等感官質量指標。