質譜在煙業化學的運用進展

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本文作者：姬厚偉劉劍葉沖萬強韓偉王芳楊敬國楊虹杰作者單位：貴州中煙工業有限責任公司

質譜技術因其靈敏度高、特異性好、響應速度快的優點在現代眾多分析檢測技術中備受矚目，自始于20世紀初發展以來，質譜技術在不斷的創新中取得了完善和成熟。其發展主要有兩方面：離子化技術和質量分析器，較為突出的就是軟電離離子化技術的興起和發展。相對于電子轟擊，由于離子化條件較溫和因而被稱為軟電離，主要包括化學電離（CI）、大氣壓化學電離（APCI）、激光解吸電離（LDI）、單光子離子化（SPI）、電噴霧離子化（ESI）和基質輔助激光解吸／電離（MALDI）等。軟電離特點是所需離子化能量少、碎片少，因而分子離子峰和加合物峰較為明顯，在結合質譜如飛行時間、四極桿質量分析器、離子阱、傅里葉變換離子回旋共振（FT－ICR）等技術分析時，分子離子峰和加合物離子峰通常被作為特征離子峰用于化合物的定性定量分析，從而大大提高方法的檢測靈敏度和選擇性。因此，軟電離質譜技術在當前多個分析領域扮有重要角色，而串聯質譜技術的應用也使得軟電離質譜技術在對復雜樣品中痕量成分的分析中體現出了高靈敏度和高選擇性優勢，使定性定量分析更為準確、可靠，在食品、醫藥、環境等多個領域得到了廣泛的應用［1］。

本文綜述了軟電離質譜技術原理、特點和應用領域，以及軟電離質譜技術在煙草及煙氣中有害成分測定、實時在線卷煙煙氣測定、致香物質的分離與鑒定、農殘測定等方面的應用。

1化學電離質譜

化學電離質譜（CI－MS）［2］是引入一定壓力的反應氣進入離子化室，反應氣在具有一定能量的電子流的作用下電離或者裂解。生成的離子與反應氣進一步發生反應或與樣品分子發生離子分子反應，通過質子交換使樣品分子電離。

化學電離作為一種軟電離技術，離子化所需能量較少，碎片較少，因而質子化峰和復合物峰較為明顯。在化學電離質譜中，電離過程是通過反應氣產生的反應離子與樣品分子之間的離子－分子反應實現的，其反應種類主要有質子轉移反應、電荷交換反應、氫負離子轉移反應和加合與締合反應。常用的反應氣有甲烷、異丁烷和氨氣，但有時為了特殊的分析目的，如不飽和化合物的雙鍵位置的確定、幾何異構體的區分、對映異構體的區分甚至手性化合物絕對構型的確定等，在化學電離質譜中需采用跟目標物有特殊的加合反應的反應氣。因此，反應試劑的選擇可以使化學電離獨特優勢得以充分體現［3］。

由于反應試劑和樣品分子之間的質子親和勢差異，化學電離相對轟擊電離源（EI）有較高的選擇性，而且CI－MS相對于EI－MS有較高的靈敏度和重復性，因此，自1966年Munson等［4］正式引入化學電離技術后，化學電離質譜技術和電子轟擊電離質譜相比，具有碎片離子少、分子離子峰和復合物峰較為明顯、選擇性高等優點在有機化合物結構分析、氣相中離子分子反應、石油化工、農殘測定等分析化學領域得到了推廣和應用，使其成為一種應用較為廣泛的分析技術。

在煙草化學分析領域中，Einolf等［5］最早使用氨氣作為反應氣，采用直接化學電離質譜技術測定了煙葉中的蔗糖酯，無需凈化步驟，顯示了較高的靈敏度和選擇性。可能由于化學電離屬于軟電離，對復雜基質分析受靈敏度的限制，因而在煙草分析中未得到廣泛應用，直到2006年，一種混合化學電離離子源（HCI）的出現，提高了化學電離質譜技術的靈敏度和選擇性［6］，該離子源主要使用了反應試劑離子由反應試劑通過外源電子轟擊離子化產生，然后被引入到離子阱里和由色譜分離并通過傳輸線進入離子阱的被分析物發生離子－分子反應，從而使被分析物離子化，生成準分子離子和加合物離子。與傳統的化學電離相比，該離子化方式避免了反應試劑和中性氣體的離子－分子反應，從而降低了背景的噪聲影響，提高了靈敏度。因而Zhang等［7］首次使用該離子源發展和建立一種選擇性測定煙草吡啶類生物堿方法，即由全氟三丁胺（PFTBA）作為反應試劑的GC－正化學電離源（PCI）－MS方法。

PFTBA反應試劑的選擇性主要體現為在氣相中通過和吡啶或含有吡啶基官能團的化合物離子－分子形成加合物的特征離子：［M＋69］＋，［M＋131］＋和［M＋264］＋。反應通過優化PCI的條件，PFTBA－PCI在選擇離子模式下對煙草中6種生物堿進行定量分析，顯示了很好的選擇性、重復性和靈敏度。該方法將是測定煙草生物堿一種新的選擇，同時也可用于其他基質中含有吡啶基官能團的化合物的測定。

2電噴霧質譜

電噴霧質譜（ESI－MS）是20世紀發展起來的一種重要的軟電離質譜技術。其原理是在輸送樣品溶液的毛細管出口端與對應電極之間施加數千伏的高電壓，在毛細管出口可形成圓錐狀的液體錐。由于強電場的作用，引發正、負離子的分離，從而生成帶高電荷的液滴。在加熱氣體（干燥氣體）的作用下，液滴中的溶劑被氣化，隨著液滴體積逐漸縮小，液滴的電荷密度超過表面張力極限（雷利極限），引起液滴自發的分裂，亦可稱為"庫侖爆炸"。分裂的帶電液滴隨著溶劑的進一步變小，最終導致離子從帶電液滴中蒸發出來，產生單電荷或多電荷離子［8］。由該電離方式能產生多電荷離子，增加了分析的質量范圍，既可用于小分子物質的分析，又可用于大分子物質如多肽、蛋白和糖類等的分析。

當前，電噴霧質譜技術在煙草領域的應用主要集中在煙葉和卷煙煙氣中有害成分的分析、農殘、致香物質的鑒定等方面。

2．1有害成分分析方面

Wagner等［9］建立了同位素稀釋液相色譜－電噴霧串聯質譜定量分析卷煙主流煙氣中4種煙草特有亞硝胺（TSNA）的方法，和傳統的方法相比，顯示了較高的靈敏度。Wu等［10］將這一方法進行了改進，以4種同位素內標取代了之前2種同位素內標，有效減小基質影響，提高了分析精確度和回收率。Saha等［11］采用液相色譜－電噴霧串聯質譜快速同時測定卷煙主流煙氣中6種致癌芳香胺類化合物，檢出限為0．04～0．59ng•支－1。Saha等［12］還采用固相萃取液相色譜－電噴霧串聯質譜測定了卷煙主流煙氣中吡啶、2－甲基吡啶、4－甲基吡啶和喹啉，檢出限為1．74～14．32ng•支－1，相對標準偏差（RSD）小于9％。Geardi等［13］以3－cyanoproxyl（3－CNP）自由基作為誘捕劑涂在劍橋濾片上，用液相色譜－串聯質譜法（LC－MS／MS）結合前體離子監測（PIM）、選定的反應監測（SRM）、選擇的離子監測（SIM）等檢測模式探測卷煙煙氣中碳核自由基，從煙氣中發現了甲酸基、巴豆酰基、丙烯醛、氨基羰基和苯胺羰基自由基。LeFaouder等［14］還利用nanoLC－nanoESIFT－ICRMS／MS成功地鑒定和定量了卷煙煙氣中的自由基（CN•和CH3•等）。嚴莉紅等［15］還采用負離子模式電噴霧LC－MS／MS定量分析側流煙氣中8種揮發性羰基化合物，8種羰基化合物測定值的RSD在6％以下，檢出限均小于2．8ng•支－1，回收率在87．2％～104．7％之間。與以往的分析方法相比，該方法具有更高的選擇性，靈敏度也明顯提高。

2．2農殘的分析方面

Liu等［16］使用高效液相色譜－紫外檢測－電噴霧質譜聯用法同時測定了煙草中二甲戊樂靈、異丙樂靈和丁樂靈3種除草劑的殘留，定量限分別為0．05，0．08，0．06mg•kg－1，回收率在77．5％～91．8％之間。Mayer－Helm等［17］使用高效液相色譜－電噴霧串聯質譜法在多反應監測模式下定量分析了煙草中18種氨基甲酸酯農殘，該方法回收率在80％～110％之間，RSD小于30％，定量限在0．01～0．2mg•L－1范圍內。Mayer－Helm等［18］還采用反相高效液相色譜－電噴霧串聯質譜法同時測定煙葉中52種殺蟲劑，通過流動相添加劑的選擇來提高檢測靈敏度和精確度，回收率在70％～120％之間，定量限為10ng•g－1。廖雅樺等［19］采用凝膠滲透色譜凈化－液相色譜－電噴霧串聯質譜法測定了煙草中3種抑芽劑殘留，平均回收率在86．2％～108．4％之間，3種抑芽劑的RSD為1．1％～7．5％，檢出限為0．01～0．06μg•kg－1。Hu等［20］建立了快速的前處理步驟，煙草中15種有機磷農殘用液相色譜－電噴霧串聯質譜法測定，檢出限為2．58～11．54μg•kg－1，RSD小于9％。王駿等［21］用乙酸－乙腈提取，基質固相萃取凈化，UPLC－MS／MS法測定了31個烤煙煙葉樣品中啶蟲脒和吡蟲啉殘留量，吡蟲啉和啶蟲脒檢出限均為0．01mg•kg－1，啶蟲脒的回收率在91．6％～102．5％之間，RSD為3．59％～4．52％；吡蟲啉回收率在90．1％～102．1％之間，RSD為3．85％～4．47％。

2．3致香物質分析方面

Li等［22－23］采用液相色譜－電噴霧離子阱多級質譜法，無需繁瑣的衍生和皂化步驟，使用蔗糖八乙酸酯作為內標，建立了香料煙中蔗糖酯快速高靈敏度定量方法，檢出限、定量限分別為1．2，3．9μg•g－1，回收率在95％～97％之間。Li等［24］還將正相液相色譜分離結合反相液相色譜－電噴霧質譜應用于香料煙煙葉表皮極性化合物分析鑒定，結果83種化合物被測出含有43種質體色素類化合物、15種賴百當類、20種蔗糖酯和3種葡萄糖酯。吳新華等［25］采用超高效液相色譜－電噴霧串聯質譜法在多反應監測（MRM）模式下并結合氣相色譜－質譜法的標準譜庫檢索分離鑒定了煙草中5種主要的糖苷類香味前體物質，為應用液相色譜－質譜分析缺乏標準樣品的糖苷類香味前體物質奠定了基礎。吳新華等［26］還采用超高效液相色譜－電噴霧串聯四極桿質譜在多反應離子監測（MRM）模式下，借助中性丟失方法，確定了熊果苷、香豆酸－葡萄糖苷、香豆素奎尼酸、新綠原酸、綠原酸、葡萄糖基阿魏酸、3－氧化紫羅蘭醇葡萄糖苷等7種致香型物質。朱瑞芝等［27］建立了同時測定煙葉中苯甲酸、鄰苯二甲酸、4－香豆酸、咖啡酸和阿魏酸5種酸的超高效液相色譜－串聯四極桿線性離子阱質譜法，本方法用于實際樣品的檢測，具有快速、準確及靈敏度高的特點，RSD在0．52％～4．9％之間，回收率在93．3％～104．7％之間、檢出限為0．05～1μg•L－1。Wang等［28］使用液相色譜－電噴霧串聯質譜，建立簡單有效的煙草中3種主要Amadori致香化合物的定性定量方法，為煙草中致香物質Amadori化合物的分析提供了一種有效的分析方法。黃翼飛等［29］采用液相色譜－電噴霧離子阱串聯質譜同時測定了煙草中20種游離氨基酸，該方法前處理簡單，無需進行衍生和固相萃取等其他前處理步驟，20種氨基酸的檢出限（3S／N）為0．01～0．05μmol•L－1，峰面積測定值的RSD為0．78％～4．93％，因其高的分析效率、靈敏度和選擇性，已成功應用于多種煙草樣品中氨基酸的測定。

3大氣壓化學電離質譜

大氣壓化學電離（APCI）是指在大氣壓環境下，溶劑和樣品流過進樣器，在進樣器內有一加熱器使溶劑和樣品加熱氣化，產生的氣態分子被由電暈針產生的電子流所電離，使溶劑離子化，溶劑離子再與樣品分子發生分子－離子反應，使樣品離子化并引入質量分析器檢測。這個過程和傳統的化學電離很類似，所不同的是傳統的化學電離是在真空下電子轟擊溶劑使之電離，而大氣壓化學電離是在常壓下靠放電針電暈放電使溶劑電離。大氣壓化學電離對相對分子質量不大的弱極性化合物的定性、定量比較準確，采用這種離子源進行的分析不易形成多電荷分子碎片，譜圖較簡單，與電噴霧相比，它的優點是流動相的適用范圍更廣［1］。因而，大氣壓化學電離質譜比較適合易揮發、熱穩定、低極性和半極性的小分子化合物的定性定量分析、藥物動力學研究等［30］。Zurek等［31］借助N－甲基－4－肼－7－硝基苯并呋喃衍生化，用液相色譜－大氣壓化學電離質譜內標法測定卷煙煙氣中乙醛等羰基化合物，其結果與紫外－可見光檢測器測定結果一致。Pang等［32］用高效液相色譜－大氣壓化學電離質譜測定和表征煙葉中糖苷類化合物，MS／MS、MS3和光電二級管陣列檢測器被用于糖苷類化合物的表征和鑒定，對檢測出的12種糖苷類中的4種進行了定量分析。黃翼飛等［33］采用液相色譜－質譜法，將煙草樣品用甲醇振蕩提取30min，無需進行其它前處理，然后使用C18柱快速分離，用不帶碰撞能量的二級質譜全掃描選擇定量離子m／z613．6，測定了煙草中的茄尼醇，檢出限為0．4μg•L－1，RSD為1．1％。王海艷等［34］采用MCX陽離子柱固相萃取凈化、大氣壓電離模式下液相色譜串聯四極桿質譜測定了8種卷煙樣品主、側流煙氣中8種雜環胺的含量，該方法的檢出限為0．042～2．8ng•支－1，回收率在68％～108％之間，RSD為1．6％～8．8％。Ishida等［35］采用液相色譜－光電二極管陣列檢測器和大氣壓化學電離質譜測定了煙葉中葉綠素的代謝物，包括羥基脫鎂葉綠素、茄尼基脫鎂葉綠（甲酯－）酸和羥基茄尼基脫鎂葉綠（甲酯－）酸被分離鑒定。Enos等［36］采用2，4－二硝基苯肼作為乙醇醛衍生化試劑，無需傳統方法凈化步驟，使用液相色譜－大氣壓化學電離串聯質譜法測定卷煙主流煙氣中的乙醇醛，檢出限為50ng•支－1。Glazier等［37］使用液相色譜－大氣壓化學電離串聯質譜法測定卷煙主流煙氣中的香豆素，檢出限為11ng•支－1。Cotte等［38］使用APCI－MS在SIM模式下實時檢測卷煙煙氣中香味成分的釋放和持久性，顯示了較高的靈敏度。

4激光解吸電離質譜

激光解吸離子化［39］是采用光子轟擊樣品電離，屬于粒子誘導離子。開始于80年代，作為傅里葉變換離子回旋共振質譜（FT－ICRMS）和飛行時間質譜（TOF－MS）的離子化方式，已成功地用于對無機物、合成聚合物以及低相對分子質量生物分子的分析，成為分析非揮發性有機物的重要方法之一。由于該離子化方式的缺點在于分子離子的軟解吸依賴于相對分子質量的大小，從而限制了熱不穩定大分子的離子化［40－41］。1988年，Karas等［42］發展和建立了基質輔助激光解吸離子化（MALDI）技術，即將溶于適當基質的樣品涂布在金屬靶上，用高強度的紫外或紅外脈沖激光照射可實現樣品的離子化。該技術克服了直接用激光解吸離子化的缺陷，為分析非揮發性、熱不穩定、高質量數的大分子提供理想的離子化方法。Carré等［43］成功地將激光解吸離子化傅里葉變換離子回旋質譜（LDI－FT－ICRMS）用于卷煙煙氣的表征，檢出了無機硝酸鹽和硫酸鹽，煙堿以及相關的生物堿，煙草特有亞硝胺，稠環芳烴，多氧取代化合物并通過質量的高分辨率和精確質量測定確定了質荷比小于250的化合物分子式。Sun等［44］使用頂空液相微萃取結合基質輔助激光解吸離子化－傅里葉變換質譜（MALDI－FT－MS）通過精確質量測定檢測鑒定出了25種煙葉中含氮化合物，該方法快速、靈敏，并具有用于高通量分析自動化的潛力，為復雜樣品中痕量揮發性有機物的分析提供了一種替代方法。Xie等［45］使用頂空液相微萃取結合基質輔助激光解吸離子化－傅里葉變換質譜（MALDI－FTMS）定量測定單口卷煙主流煙氣中的煙堿含量，獲得了較好的重復性（RSD＜9％）。Xie等［46］又采用單滴衍生萃取結合MALDI－FT－ICRMS用于測定單口主流煙氣中的小分子醛類化合物，二苯胺和2，5－二羥基苯甲酸（DHB）的混合物作為萃取液滴，并定量測定了單口主流煙氣中的甲醛和丙烯醛，檢出限分別為40，60fmol•L－1，RSD為7．3％。Schramm等［47］使用激光解吸離子化傅里葉變換離子回旋共振質譜研究了卷煙主流（MSS）和側流煙氣（SSS）的粒相物。通過高分辨率和精確質量測定可檢測到m／z150～500范圍內每個信號的分子式。通過對檢測到的質譜圖提取信息和數據分析，建立了Ken－drick和VanKrevelen圖表并通過圖表可以用來分析卷煙煙氣的差異：不同卷煙的MSS間的差異和同一支卷煙MSS和SSS的差異。

5單光子電離質譜

單光子電離質譜（SPI－MS）是一種近年來興起的軟電離質譜技術，它主要是利用大部分原子和分子的電離能都處在真空紫外（VUV）光波段的能量范圍內的原理，以單個VUV光子實現對分析物分子的電離［48］。由于真空紫外光源的光子能量一般大于常見分析物分子的電離勢，而且小于空氣組分和常用溶劑的電離勢，因此，選擇合適的波長就可選擇性的電離待測物，減少基體物質的干擾［49］。故而，采用單光子電離質譜進行樣品分析時，無需復雜的樣品處理過程，即可實現較高的檢測靈敏度。目前，這一電離方式主要與飛行時間質量分析器結合組成質譜儀用于分析。這一技術在煙草分析方面的應用研究主要集中在卷煙煙氣的在線分析上。Adam等［50］將單光子電離（SPI）－時光質譜（TOFMS）的激光技術用于對主流煙氣逐口分析。通過將SPI－TOFMS與經改造后的單通道吸煙機結合實現了卷煙抽吸過程中單口煙氣在線實時分析。Adam等［51］還基于單光子電離（SPI）－飛行時間質譜（TOFMS）的激光技術對主流煙氣（MS）進行逐口煙氣分析，成功地定量了逐口煙氣中一氧化氮、乙醛、丁二烯、丙酮、異戊二烯、甲苯、乙苯和二甲苯等8種揮發性有害成分。Mühlberger等［52］則將脈沖電子束抽運準分子真空紫外燈用作單光子電離光源，用于在線實時監測卷煙主流煙氣中的脂肪族和芳香族化合物，檢出限小于50μg•L－1。Hertz等［53］研究設計了一根不銹鋼針尖的微探針，采用該微探針結合SPI－TOFMS實現了對燃燒卷煙內部的半揮發性芳香類、脂肪類（1，3－丁二烯、橡膠基質、丙酮和乙醛）以及煙堿等在線即時分析。

6展望

軟電離質譜技術的發展極大地推動了質譜技術的進步，使質譜技術迅速地成為化學分析研究中不可替代的工具。近年來，質譜技術在煙草化學研究中的應用得到煙草化學領域的普遍重視，以軟電離質譜為特征的分析手段已經在煙草化學領域中得到廣泛的應用。將軟電離質譜技術與煙草化學分析的特有手段結合的分析方法極大地提高了煙草化學分析中分析方法的靈敏度、準確度和方法的自動化水平，有效地促進了煙草化學研究的進步與發展。但是煙草和卷煙煙氣都是極其復雜的化學體系，對煙草化學研究人員而言，對其化學成分的分析和鑒定一直是一種挑戰。現有的軟電離質譜技術盡管帶來快捷和自動化分析手段，但樣品前處理依然是分析效率的制約因素，尤其是對痕量化合物的分析。因此，原位、實時、在線、非破壞、高通量、低損耗的質譜學方法是現代質譜分析技術發展的重要趨勢，新興軟電離質譜技術旨在與對復雜基體樣品進行直接分析，在很大程度上提高了分析效率［54］。此外，軟電離質譜可通過離子、分子反應來提高分析方法的選擇性，但其在煙草分析領域的應用研究還較少。通過特殊的離子、分子反應來選擇性測定煙草及煙氣復雜基體中的化合物是未來軟電離質譜技術在煙草化學研究、應用的發展方向之一。