醫(yī)學(xué)益母草堿HPLC檢測(cè)

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【摘要】目的建立益母草中益母草堿的hplc檢測(cè)方法。方法C18色譜柱，流動(dòng)相：甲醇pH=1.7的醋酸/醋酸鈉緩沖液（體積比85∶15），流速0.6mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)277nm，靈敏度0.1AUFS，柱溫25℃。結(jié)果益母草藥材中益母草堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.015％;平均回收率為100.08%，RSD為0.15%。結(jié)論高效液相色譜直接檢測(cè)益母草堿，簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

【關(guān)鍵詞】益母草；益母草堿；高效液相色譜法

益母草為唇形科植物益母草(LeonurusheterophyllusSweet)的干燥地上部分，以花蕾期的地上部分的干品或鮮品入藥，性味苦、辛、微寒，歸肝、心包經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)、化瘀生新、收縮子宮之功效，主治月經(jīng)不調(diào)、胎漏難產(chǎn)、行經(jīng)腹痛及產(chǎn)后淤阻等證，素有“血家圣藥”、“經(jīng)產(chǎn)良藥”之稱。益母草中主要含有生物堿類、二萜類、甾醇、黃酮類、有機(jī)酸、脂肪酸類等成分。益母草中生物堿以益母草堿和水蘇堿為主［1］。藥理作用研究證明，益母草中的主要有效成分益母草堿(leonurine)具有顯著的直接擴(kuò)張外周血管、增加血流量、抗血小板聚集活性等作用［2］，可有效的降低血液黏度和提高紅細(xì)胞的變形能力，還可調(diào)經(jīng)止血，保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。在《中國(guó)藥典》［3］及各級(jí)別標(biāo)準(zhǔn)中，益母草藥材和益母草制劑的質(zhì)量控制均是以總生物堿為指標(biāo)，文獻(xiàn)［4，5］則采用雷氏鹽剩余比色法測(cè)定益母草中鹽酸水蘇堿。而對(duì)于益母草堿的含量卻沒(méi)有要求，這樣不能保證益母草及其制劑的安全、有效。以益母草為原料的多種制劑，如益母草膠囊、益母草沖劑、益母草口服液、益母草浸膏、益母草片等都是臨床上的常用品,除個(gè)別品種在《中國(guó)藥典》2005年版增加了含量測(cè)定項(xiàng)目外,多數(shù)品種無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),有的品種則無(wú)含量測(cè)定要求,使市售的產(chǎn)品質(zhì)量得不到保證。所以建立一個(gè)以益母草堿為指標(biāo)直接檢測(cè)益母草藥材及其制劑的統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是很有意義的。本文嘗試建立益母草堿的高效液相色譜直接檢測(cè)方法。

1儀器與材料

高效液相色譜儀LabAlliance，LabAlliance紫外檢測(cè)器Model5000，PhenomenexC18柱(4.6mm×250mm，5μm),Anastar色譜工作站；紫外分光光度計(jì)，SHIMADZU公司，UV2401PC。甲醇為一級(jí)色譜純；益母草堿對(duì)照品（購(gòu)于安徽省新星藥物開發(fā)有限責(zé)任公司，純度為99％）；益母草（購(gòu)于天津市南開區(qū)協(xié)和藥店，經(jīng)我校中藥學(xué)院中藥鑒定教研室張麗娟副教授鑒定）。

2方法與結(jié)果

2.1紫外光譜最大吸收測(cè)定在200~400nm之間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，掃描圖如圖1所示，益母草堿在215nm和277nm處均有吸收峰，最大吸收277nm，故選用277nm作為高效液相測(cè)定的波長(zhǎng)。

2.2色譜條件色譜柱：PhenomenexC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇pH=1.7的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液（體積比85∶15），流速：0.6mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：277nm，靈敏度：0.1AUFS，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20μL。

2.3對(duì)照品溶液的制備精密稱取鹽酸益母草堿0.6mg，溶于25mL流動(dòng)相中，搖勻，制得0.024mg·mL-1對(duì)照品溶液。分別取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、5mL溶于5mL流動(dòng)相中，分別搖勻，得質(zhì)量濃度分別為00024、0.0048、0.0072、0.0096、0.024mg·mL-1的對(duì)照品溶液。各用微孔濾膜濾過(guò)后，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定（HPLC分析如圖2所示），測(cè)得各溶液峰面積，計(jì)算得回歸方程：C=2.222×10-8A－6.213×10-4,r=0.9998。益母草堿在00024~0.024mg·mL－1間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1全波長(zhǎng)掃描圖（略）

Fig.1Wavelengthscanningofmotherwortalkaloids

圖2對(duì)照品HPLC分析圖（略）

Fig.2HPLCchromatogramofreferencesubstance

2.4樣品溶液的制備精密稱取益母草提取物粗品2.2mg，溶于10mL流動(dòng)相中，搖勻即得。

2.5樣品溶液的測(cè)定取樣品溶液用微孔濾膜濾過(guò)后，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得溶液的峰面積為1099398，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.82％，在原藥材中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.015％。

2.6精密度試驗(yàn)取同一樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積分別為1106469、1110843、1099260、1106190、1103044、1112296，平均峰面積為1106350.3，計(jì)算得RSD=0.98%。表明儀器精密度符合要求。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一樣品溶液于室溫下在配制后的0、2、4、6、8、10、12h，按“2.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得峰面積分別為1108469、1099351、1120020、1123215、1110362、1109472、1137277，平均峰面積為1115452.3，結(jié)果RSD＝1.11％，可見供試品溶液在室溫條件下12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重現(xiàn)性試驗(yàn)取同一樣品溶液6份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定測(cè)得質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.82％、1083％、10.79％、10.80％、10.81％、10.83％，平均為10.81％，RSD＝0.15％。

2.9加樣回收率試驗(yàn)取益母草堿粗制品3.6mg,用流動(dòng)相溶解后，精密加入益母草堿對(duì)照品0.4mg，溶液適量，置于25mL容量瓶中，以流動(dòng)相定容至刻度，搖勻。再按樣品測(cè)定方法操作測(cè)定，測(cè)得6次的峰面積分別為790165、786492、807343、810706、799324、813338，平均峰面積為801228，結(jié)果計(jì)算回收率為100.08％，RSD＝1.54％。

3討論

3.1波長(zhǎng)的確定在200～400nm之間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)吸收峰，215nm和277nm，但是215nm有可能受到甲醇吸收的影響，而且在277nm處沒(méi)有其他成分的干擾，所以選擇最大吸收波長(zhǎng)277nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2色譜條件的建立分別考察了不同體積比的甲醇水、甲醇水三乙胺、甲醇水冰醋酸、甲醇緩沖溶液等流動(dòng)相，最終選擇甲醇緩沖溶液作為流動(dòng)相。選擇用酸性流動(dòng)相，是因?yàn)橐婺覆葜幸婺覆輭A的存在形式有可能有兩種，即益母草堿單體及其鹽類，利用酸性流動(dòng)相可以轉(zhuǎn)化成鹽類一種形式，測(cè)定時(shí)只出現(xiàn)單一的峰。選擇緩沖溶液，是因?yàn)榫彌_溶液是一個(gè)平衡體系，比較穩(wěn)定，有利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

3.3本文是在完成了分離益母草堿和水蘇堿的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了益母草堿的高效液相色譜的直接檢測(cè)方法，為益母草藥材的質(zhì)量控制及其他益母草制劑的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。該方法簡(jiǎn)便易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

【參考文獻(xiàn)】

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［4］安偉建.中藥益母草有效成分提取和測(cè)定方法的研究進(jìn)展［J］.天津藥學(xué)，2003，15（3）：68.

［5］晁志,周秀佳.益母草類中藥研究概況與進(jìn)展［J］.中草藥,1998，29(6):414-417.