斑點(diǎn)雜交條件建立優(yōu)化

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【摘要】目的進(jìn)行斑點(diǎn)雜交條件的建立及優(yōu)化。方法采用帶正電荷的尼龍膜對斑點(diǎn)雜交的每一步驟進(jìn)行優(yōu)化，包括預(yù)雜交液，雜交液，洗滌和封閉液等及各步反應(yīng)時間，并采用最終確立的條件檢測糖基轉(zhuǎn)移酶基因多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2（pp-GalNAcT2）在K562、NB4、NIH3T3和SGC7901細(xì)胞株中的差異表達(dá)以驗證膜雜交條件的可行性。結(jié)果建立并優(yōu)化了膜斑點(diǎn)雜交的條件，本底清晰，結(jié)果可靠。結(jié)論建立的斑點(diǎn)雜交技術(shù)經(jīng)濟(jì)簡便，切實可行。

【關(guān)鍵詞】斑點(diǎn)雜交；糖基轉(zhuǎn)移酶；基因

Theestablishmentandoptimizationofthedotblotprerequisite

【Abstract】ObjectiveToestablishandoptimizethedotblottechnique.MethodsWeusedthepositivelychargednylonmembranestooptimizeexperimentsforthedotblotincludingprehybridizationsolution，hybridizationsolution，washingbuffer，blockingsolutionetal，andthetimesofeverystep.Inordertovalidateitsfeasibility，weanalyzedtheexpressionofppGalNAc-T2indifferenttumorcelllinesbydotblotassayusingtheestablishedhybridizationsystem.ResultsWeestablishedandoptimizedthedotblottechniquewhichhadreliableresultsandlowbackground.ConclusionTheestablisheddotblottechniqueispracticableandeconomical.

【Keywords】dotblot；glycosyltransferase；gene

基因的表達(dá)分析研究是分子生物學(xué)實驗中較為常用的手段，主要有Northernblot和斑點(diǎn)雜交(dotblot)等，因斑點(diǎn)雜交無需轉(zhuǎn)膜，且DNA或RNA相對固定在一定的區(qū)域內(nèi)，實驗要求相對簡單，因此斑點(diǎn)雜交更易為實驗者所接受。目前一般均用商品化的試劑盒，但其價格昂貴，不是一般實驗室所能普及，因此我們采用自配的試劑建立并優(yōu)化了一套斑點(diǎn)雜交方法，無需特殊設(shè)備，經(jīng)濟(jì)簡便，結(jié)果可靠。

1材料與方法

1.1多肽N-乙酰氨基半乳糖轉(zhuǎn)移酶2（UDP-GalNAc:polypeptideN-acetylgalactosaminyltransferases2，pp-GalNAcT2EC2.4.1.41）基因的獲得。取pp-GalNAcT2克隆載體轉(zhuǎn)染DH5α工程菌，篩選白色陽性克隆，抽取質(zhì)粒，用M13正向、反向引物進(jìn)行克隆PCR，M13Forward5′-GTAAAACGACGGCCAG－3′，M13Reverse5′－CAGGAAACAGCTATGAC－3′，電泳鑒定結(jié)果，可見約1200bp左右的條帶。即獲得相應(yīng)的ppGalNAc-T2cDN段。

1.2采用T2特異的寡核苷酸探針進(jìn)行斑點(diǎn)雜交法條件的建立及優(yōu)化探針序列如下：5′-GAAAGACCTTCATCACAGCAATGGAGAAGAA，與ppGalNAc-T2cDNA序列互補(bǔ)，長31bp。探針合成及探針5′端生物素標(biāo)記均由上海生工生物工程公司完成。

1.2.1斑點(diǎn)雜交操作程序(1)以上述所得pp-GalNAcT2的cDN段以1NNaOH和200mM的EDTA對比稀釋，使成0.4NNaOH和10mM的EDTA的終濃度。(2)把稀釋的pp-GalNAcT2的cDN段在100℃變性5min，迅速置冰，冰冷10min以上。(3)膜（購自Amersco公司，帶正電荷）用滅菌雙蒸水浸泡10min，懸空晾干。(4)每點(diǎn)2μl把pp-GalNAcT2的cDN段點(diǎn)在尼龍膜上，濕膜在紫外燈下照2min，取出讓膜干燥。(5)雜交時以2×SSC浸膜5min，裝入雜交袋，根據(jù)VECTORNIT軟件計算雜交溫度的方法確定雜交溫度為42℃。以每100cm2膜加20ml的預(yù)雜交液（50％的去離子甲酰胺，5×SSC，0.1%SDS，0.1%BSA，0.1%PVP，用pH7.5的PB調(diào)終體積）于42℃預(yù)雜交2～3h。(6)棄去預(yù)雜交液，在雜交液（50％的去離子甲酰胺，5×SSC，0.1%SDS，0.1%BSA，0.1%PVP，10％的硫酸葡聚糖，100μg/ml的剪切的鮭魚精DNA，用水調(diào)終體積）中加入適量探針，以每100cm2膜加10ml的雜交液于42℃雜交過夜。(7)用足量洗滌液1（2×SSC，0.1%SDS）于42℃洗滌2次，再用洗滌液2（0.5×SSC，0.1%SDS）于55℃嚴(yán)謹(jǐn)洗滌2次。(8)用蒸餾水淋洗膜2～5min，然后用封閉液（不同濃度的BSA，0.1MNaCl，0.2%Triton-100，0.1MTris，pH7.5）封閉。(9)倒出封閉液，加入用封閉液配制的適當(dāng)比例稀釋的卵白素-堿性磷酸酶（購自上海華舜生物工程有限公司），37℃孵育30min。(10)洗滌液3（0.1MTris，0.15MNaCl，0.3%Tween20pH7.5）在37℃洗膜2次，檢測緩沖液（0.1MTris，0.1MNaCl，0.1MMgCl2，pH9.5）平衡，再以每10ml檢測緩沖液加66μlNBT和11μlBCIP(均購自上海華舜生物工程有限公司)的顯色液顯色。(11)顯色結(jié)束后以TE終止，用掃描儀獲取圖像。

1.2.2斑點(diǎn)雜交建立及優(yōu)化程序(1)尼龍膜上不點(diǎn)任何樣品，以下述條件行假雜交反應(yīng)。雜交液中探針的終濃度為：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml；酶的稀釋比例為：1／400、1／800、1／2000、1／5000；封閉液中BSA的終濃度為：2％，封閉2h；雜交后洗滌液1和2分別洗2次，每次1h；封閉后洗滌液洗2次，每次1h；檢測緩沖液平衡1h；顯色30min。

（2）以（1）所獲得的最佳本底，在尼龍膜上點(diǎn)上pp-GalNAcT2的cDN段，其余條件不變，封閉液中BSA的濃度設(shè)計成2％、3％和5％三梯度進(jìn)行雜交反應(yīng)

（3）以（2）所獲得的最佳條件，改進(jìn)以下條件：①雜交后洗滌時間每次1h;每次30min；每次10min；②封閉液封閉時間2h;1.5h;50min；③封閉后洗滌時間由每次1h;每次40min;每次20min；④檢測緩沖液平衡時間由1h；30min;10min；⑤顯色以出現(xiàn)清晰的陽性信號，本底最低為尺度，一般在15min左右，時間延長本底升高。

1.3斑點(diǎn)雜交法檢測K562、NB4、NIH3T3和SGC7901細(xì)胞株pp-GalNAcT2的表達(dá)差異NIH3T3成纖維細(xì)胞、胃癌細(xì)胞株SGC-7109、白血病細(xì)胞株K562和NB4購自上海生化細(xì)胞所；RNA抽提試劑TRIZOL、PCR試劑盒、pUCMixDNAmarker和ladder購自Invitrogen公司，六隨機(jī)引物購自Takara公司。實驗所用pp-GalNAcT2和β微球蛋白（內(nèi)對照）引物采用Genetyx軟件設(shè)計，并經(jīng)GenBankBlast同源檢索后由上海生工生物技術(shù)公司合成。

β-MG引物序列為：

F：5′-CTCGTGCTACTCTCTCTTTC-3′

R：5′-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3′

預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度330bp。

ppGalNAc-T2引物為：

F：5′-GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC-3′

R：5′-CTGTGTCAATGTAAACATAGCTC-3′

預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為668bp。

采用TRIZOL法抽提K562、NB4、NIH3T3和SGC7901細(xì)胞株RNA，測A260/A280比值和電泳圖譜鑒定抽提完整性，測A260定量，六隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄制作cDNA。倍比稀釋點(diǎn)膜，用pp-GalNAcT2特異的寡核苷酸探針與膜雜交；同時以上述獲得的K562、NB4、NIH3T3和SGC7901細(xì)胞株cDNA加pp-GalNAcT2和β-MG正反向引物行RT－PCR來驗證斑點(diǎn)雜交結(jié)果。

2結(jié)果

(1)尼龍膜上不點(diǎn)任何樣品所進(jìn)行的假雜交反應(yīng)結(jié)果如圖1所示，可見以雜交液中探針的終濃度為10ng/ml，酶的稀釋比例為1／5000時本底最低；以此條件，在尼龍膜上點(diǎn)上pp-GalNAcT2的cDN段，封閉液中BSA的濃度設(shè)計成2％、3％和5％三梯度，其余條件不變的雜交反應(yīng)結(jié)果如圖2所示，可見以5％的BSA封閉效果最佳；再以上述確立的條件改進(jìn)雜交反應(yīng)各步的時間，以簡化實驗，如圖3所示，可見條件2和條件3體系下的結(jié)果都是可以接受的，但條件3更為簡化。

(2)以上述確立的雜交反應(yīng)的條件用斑點(diǎn)雜交法檢測K562、NB4、NIH3T3和SGC7901細(xì)胞株GalINAcT2的表達(dá)差異，以驗證所確立的條件的實際可行性，結(jié)果如圖4所示，pp-GalNAcT2的表達(dá)水平依次為K562白血病細(xì)胞>胃癌細(xì)胞SGC7901>NB4白血病細(xì)胞，在NIH3T3成纖維細(xì)胞中未檢測到表達(dá)。同時再行RT-PCR確證斑點(diǎn)雜交的結(jié)果，如圖5，6所示，與斑點(diǎn)雜交結(jié)果基本一致。

3討論

我們參照分子克隆［1］和Superarray［2］操作手冊，設(shè)計并改進(jìn)預(yù)雜交液和雜交液。由于采用帶正電荷的尼龍膜為支持介質(zhì)，在堿性條件下更有利于DNA與膜結(jié)合，而預(yù)雜交的目的是封閉膜上的非特異性結(jié)合部位，因此預(yù)雜交液采用pH7.5的PB配制并調(diào)終體積；而雜交液中的探針要盡量減少與膜的非特異性雜交，因此雜交液用水來調(diào)終體積，pH值控制在6.5左右。同時，對雜交過程中所涉及的每一個步驟及試劑的配制，我們都進(jìn)行優(yōu)化，最終所確立優(yōu)化過程如下：采用自配的預(yù)雜交液和雜交液，雜交液中探針濃度為10ng/ml，雜交后洗滌液1和2各洗滌2次，每次10min，5%的BSA封閉液封閉50min，封閉后加酶稀釋比為1／5000，封閉后洗滌液洗2次，每次20min，檢測緩沖液平衡10min，顯色以出現(xiàn)陽性信號，本底最低為標(biāo)準(zhǔn)。

圖1不同的探針及酶濃度進(jìn)行假雜交反應(yīng)

A：探針濃度為200ng/ml，酶濃度為1/400

B：探針濃度為100ng/ml，酶濃度為1/800

C：探針濃度為50ng/ml，酶濃度為1/2000

D：探針濃度為10ng/ml，酶濃度為1/5000

圖2三種不同BSA濃度顯色對比

(A：BSA為5%；B：BSA為3%；C：BSA為2%)

圖3不同洗滌、封閉和顯色時間的顯色對比

A：條件1；B：條件2；C：條件3

圖47901、NIH3T3、NB4和K562四種細(xì)胞的斑點(diǎn)雜交圖

圖示1～6稀釋比例為1、1/2、1/4、1/8、1/16和1/32，每點(diǎn)cDNA上樣量為12μl，原始濃度折算成RNA為2.4μg，采用寡核苷酸探針與之雜交

圖5不同細(xì)胞株pp-GalNAcT2的RT-PCR電泳圖譜，其中1：NIH3T3細(xì)胞；2：SGC7901細(xì)胞；3：NB4細(xì)胞；4：K562細(xì)胞；M：marker；MG：β微球蛋白(內(nèi)對照)

Fig6RT-PCRanalysisofpp-Ga1NAcT2expressioninSGC7901，K562，NB4andNIH3T3cells

為進(jìn)一步檢驗?zāi)るs交條件的可行性，我們用胃腺癌SGC7901細(xì)胞、白血病K562、NB4細(xì)胞和NIH3T3成纖維細(xì)胞的cDNA以一定的稀釋比進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，檢測pp-GalNAcT2在這四種細(xì)胞中的差異表達(dá)，得到的相對表達(dá)水平為：K562白血病細(xì)胞>胃癌細(xì)胞SGC7901>NB4白血病細(xì)胞，在NIH3T3成纖維細(xì)胞中未檢測到表達(dá)。pp-GalNAcT2主要表達(dá)于富含粘蛋白的組織細(xì)胞中［3］，一般說來，能分泌較多粘蛋白的細(xì)胞pp-GalNAcT2有較高表達(dá)，如正常胃和大腸粘膜，胃癌細(xì)胞株SGC7901中pp-GalNAcT2mRNA的表達(dá)很高是可以理解的；NIH3T3是一種成纖維細(xì)胞，來源

于非上皮組織，不分泌粘蛋白，所以其pp-GalNAcT2的表達(dá)甚低。K562和NB4均是白血病細(xì)胞，其pp-GalNAcT2表達(dá)也較高，其確切的生物學(xué)意義有待闡明。雖然我們采用了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南礈鞐l件但也不排除雜交液中的探針與cDNA之間發(fā)生非特異性雜交，因此對每種細(xì)胞的cDNA行pp-GalNAcT2特異的RT-PCR，以β-MG為內(nèi)對照，對所得的T2和β-MG條帶掃描定量，比較四種細(xì)胞T2的相對表達(dá)高低，結(jié)果是與斑點(diǎn)雜交一致，證明斑點(diǎn)雜交結(jié)果是可信的，其雜交條件是可行的。另外，RT-PCR中檢測到在NIH3T3細(xì)胞中有微量的T2表達(dá)，而在斑點(diǎn)雜交中未檢出，說明顯

色法斑點(diǎn)雜交在檢測低表達(dá)基因的靈敏度上可能還不夠，可能需要增加上樣量或換用靈敏度更高的顯影或檢測系統(tǒng)來檢測低表達(dá)基因的表達(dá)水平。但是，增加cDNA上樣量會帶來相當(dāng)多的問題，主要是RNA的逆轉(zhuǎn)錄的效率，因為增加cDNA上樣量必然需要增加逆轉(zhuǎn)錄所需的RNA用量。當(dāng)然，也可以通過幾管cDNA濃縮獲得，但操作相對煩瑣。另外，可以直接做RNA的斑點(diǎn)雜交，這樣增加RNA上樣量相對容易，但RNA容易降解，操作要求高，復(fù)雜，不如cDNA的斑點(diǎn)雜交簡便，因此，相對可行的方法可能是根據(jù)實驗所需，采用所建立的cDNA斑點(diǎn)雜交體系，用不同靈敏度的檢測系統(tǒng)，如化學(xué)發(fā)光法、同位素標(biāo)記法或熒光標(biāo)記法等檢測不同的基因表達(dá)。

總之，我們成功地建立了cDNA斑點(diǎn)雜交體系，無需特殊的儀器設(shè)備，試劑成本低廉；陽性信號清晰，結(jié)果可靠，有助于在基因的差異表達(dá)等研究中的應(yīng)用。

【參考文獻(xiàn)】

1J.薩姆布魯克，E.F.弗里特，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南.北京:科學(xué)出版社，1993，362-395.

2.

3KudoT，IkeharaY，TogayachiA，etal.Up-regulationofasetglycosyltransferasegenesinhumancolorectalcancer.LabInvest，1998，78(7):797-811.