胰島素樣生長(zhǎng)因子對(duì)胚胎發(fā)育保護(hù)作用

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關(guān)鍵詞】早孕

Protectiveeffectofinsulinlikegrowthfactorsonearlypregnancy

【Abstract】AIM:TodetecttheexpressionsofinsulinlikegrowthfactorⅠ(IGFI)invillusandIGFIIindeciduaandthelevelsinmotherserum,andtoexploretheirrelationshipwiththeembryogenesisofearlypregnancy.METHODS:ExpressionsofIGFIandIGFIIwereexaminedbyimmunohistochemicalSPmethod;themRNAexpressionsofIGFIandIGFIIweredetectedbyinsituhybridization(ISH);serumIGFIandIGFIIlevelsweredeterminedbyenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA).RESULTS:TheexpressionsofIGFIandIGFIIbothproteinandmRNAwerelowerintheabnormalvillusanddeciduaofpregnancyterminationthanthoseofnormalvillusanddeciduaofnormalpregnancy（P<0.01）.SerumlevelsofIGFIandIGFIIinnormalpregnancywomenweremuchhigherthanthoseofabnormalpregnancywomen（P<0.01）.CONCLUSION:IGFIandIGFIImayplayimportantrolesintheregulationoffetalgrowth,thedecreaseofIGFIandIGFIIlevelsinvillus,deciduaandserummaybethekeyfactorcontributingtotheembryogenesisterminationofearlypregnancy.SoIGFIandIGFIIcanserveas2parametersinexaminingthefetalsafety.

【Keywords】insulinlikegrowthfactorI;insulinlikegrowthfactorII;earlypregnancy;villustermination;deciduas

【摘要】目的：探討胰島素樣生長(zhǎng)因子I和II（IGFI和II）在正常胚胎發(fā)育及早期胚胎發(fā)育終止絨毛及蛻膜組織中的表達(dá)及其在母體血中水平的改變與胚胎發(fā)育的關(guān)系.方法：分別采用免疫組織化學(xué)SP法和原位雜交法檢測(cè)正常胚胎發(fā)育絨毛及早期胚胎發(fā)育終止絨毛中IGFI和蛻膜中IGFII蛋白的表達(dá)以及IGFImRNA和蛻膜中IGFIImRNA的表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)正常妊娠及早期胚胎發(fā)育終止孕婦血中IGFI和II水平的變化.結(jié)果：免疫組化結(jié)果顯示，正常妊娠絨毛中IGFI和蛻膜中IGFII的表達(dá)明顯高于胚胎發(fā)育終止組（P＜0.01）；原位雜交結(jié)果顯示，正常妊娠組絨毛中IGFI和蛻膜中IGFIImRNA的表達(dá)明顯高于胚胎發(fā)育終止組（P＜0.01）；正常妊娠組母血中IGFI和II水平顯著高于胚胎發(fā)育終止組（P＜0.01）.結(jié)論：IGFI和II在絨毛組織中的表達(dá)及母血中的水平的升高對(duì)早期胚胎發(fā)育有重要的保護(hù)作用，其含量的減少可能是導(dǎo)致胚胎死亡的重要原因之一.IGFI和II可能成為預(yù)測(cè)胎兒安危的指標(biāo)之一.

【關(guān)鍵詞】胰島素樣生長(zhǎng)因子I；胰島素樣生長(zhǎng)因子II；早孕；絨毛；蛻膜

0引言

近年來(lái)已有大量研究表明胚胎在宮內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育是一個(gè)多因素調(diào)節(jié)的過(guò)程.Guidice等［1］證實(shí)胰島素樣生長(zhǎng)因子I（IGFI）具有調(diào)節(jié)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的作用，但是有關(guān)具體作用途徑和作用機(jī)制尚不清，而子宮內(nèi)膜中胰島素樣生長(zhǎng)因子II（IGFII）的含量隨月經(jīng)周期而改變，并與卵巢激素的作用密切相關(guān)［2-3］，因此，推測(cè)IGFs在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中可能起著重要作用.我們通過(guò)檢測(cè)正常胚胎發(fā)育孕婦及胚胎發(fā)育終止孕婦血中的IGFI水平和絨毛中的IGFI及蛻膜中IGFⅡ表達(dá)的變化，探討IGFI和IGFⅡ?qū)υ缙谂咛グl(fā)育的保護(hù)作用.

1材料和方法

1.1材料選取200309/200410西京醫(yī)院婦產(chǎn)科門(mén)診48例經(jīng)B超證實(shí)胚胎發(fā)育終止而行清宮術(shù)者的絨毛組織和蛻膜組織為實(shí)驗(yàn)組，56例因避孕失敗而實(shí)施人工流產(chǎn)的絨毛組織和蛻膜組織為對(duì)照組.兩者妊娠天數(shù)均小于84d.入選對(duì)象均為健康女性，年齡(24±2.8)歲.兔抗人IGFI和II多克隆抗體及通用型超敏SP試劑盒（北京百靈克試劑公司）；IGFI和II檢測(cè)試劑盒（DSL公司）；IGFI和II原位雜交試劑盒（武漢博士德試劑公司）.

1.2方法

1.2.1母血中IGFI和IGFII含量的檢測(cè)術(shù)前均空腹抽取靜脈血3mL，不抗凝，離心后取血清，-20℃冷凍冰箱保存.采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行.反應(yīng)終止后在EL312e型酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值，每份標(biāo)本均測(cè)雙份，取平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出IGFI和II含量.

1.2.2絨毛組織中IGFI和蛻膜組織中IGFII的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)SP染色法檢測(cè).將絨毛組織和蛻膜組織經(jīng)40g/L多聚甲醛固定后，常規(guī)制作4μm石蠟切片，一抗為兔抗人IGFI和II抗體（1∶100）,二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，以DAB顯色.具體步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.對(duì)照設(shè)置：免疫組化染色中分別以已知IGFI陽(yáng)性的肝癌和IGFII陽(yáng)性的乳腺癌作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照.檢測(cè)結(jié)果的判定：以胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色和棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào).

1.2.3絨毛組織中IGFImRNA和蛻膜組織中IGFIImRNA水平的表達(dá)采用原位雜交法檢測(cè).將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，加30mL/LH2O2室溫處理10min，用DEPC水洗2×5min.加胃蛋白酶于37℃消化30min，以0.5mol/LPBS洗3×5min，于40℃預(yù)雜交3h.用濾紙吸去預(yù)雜交液，然后雜交過(guò)夜，最后用DAB顯色.IGFI和IImRNA探針為地高辛標(biāo)記的原位雜交液，一抗為HRP標(biāo)記的鼠抗地高辛IgG.對(duì)照設(shè)置：以試劑盒內(nèi)配置的陽(yáng)性切片（肝癌）作為陽(yáng)性對(duì)照，以不加含有標(biāo)記探針的原位雜交液作為陰性對(duì)照.檢測(cè)結(jié)果的判定：以胞漿中出現(xiàn)黃色和棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào).

1.2.4圖像分析用MIAS300型圖像分析儀，輸入裝置為OlympusBH2顯微鏡和臺(tái)灣產(chǎn)MTV180型CCD攝像頭，顯微放大倍數(shù)400倍，普通光源照明.將免疫組化染色和原位雜交染色切片顯微鏡下觀察視野輸入圖像分析儀的高分辨圖像監(jiān)視器上，對(duì)陽(yáng)性產(chǎn)物相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定.在光鏡下（×100）每例隨機(jī)取樣測(cè)5個(gè)蛻膜斷面，10個(gè)單位面積，每組共測(cè)50個(gè)單位面積，計(jì)算每個(gè)單位面積陽(yáng)性產(chǎn)物的相對(duì)含量.取其平均值代表該切片陽(yáng)性物質(zhì)的相對(duì)含量.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2結(jié)果

2.1母血中IGFI和IGFII的含量ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組（正常妊娠）母血中IGFI含量為（194±145）μg/L，IGFII含量為（184±15）μg/L；而實(shí)驗(yàn)組母血中IGFI含量為（125±13）μg/L，IGFII含量為（125±13）μg/L；二者之間差異顯著（P<0.01）.

2.2絨毛組織中IGFI和蛻膜組織中IGFII的表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明，IGFI在對(duì)照組的絨毛組織中的表達(dá)以陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性為主；而在實(shí)驗(yàn)組中的表現(xiàn)陰性和弱陽(yáng)性為主.IGFII在對(duì)照組中的表達(dá)以陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性為主；而在實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)則以陰性和弱陽(yáng)性為主.兩組之間差異顯著（P<0.01,表1,圖1）.

表1絨毛組織中IGFI，IGFImRNA和蛻膜組織中IGFII，IGFIImRNA的表達(dá)（略）

bP＜0.01vs對(duì)照.

圖1絨毛組織IGFI（A）和蛻膜組織IGFII（B）的陽(yáng)性表達(dá)(表達(dá)在胞質(zhì)和胞膜上)SP×400（略）

2.3絨毛組織IGFImRNA和蛻膜組織IGFIImRNA的表達(dá)原位雜交檢測(cè)結(jié)果表明，IGFImRNA在對(duì)照組的絨毛中表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性；而在實(shí)驗(yàn)組中表現(xiàn)為陰性和弱陽(yáng)性；IGFIImRNA在對(duì)照組的蛻膜中表現(xiàn)為強(qiáng)陽(yáng)性；而在實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)為陰性和弱陽(yáng)性.IGFI和IImRNA在對(duì)照組的陽(yáng)性產(chǎn)物含量明顯高于實(shí)驗(yàn)組（P<0.01，表1，圖2）.

圖2絨毛組織IGFIMrna(A)和蛻膜組織IGFIImRNA(B)的陽(yáng)性表達(dá)(表達(dá)在胞質(zhì)和胞膜上)ISH×400（略）

3討論

胚胎是動(dòng)物個(gè)體發(fā)育的重要階段，多種生長(zhǎng)因子和激素在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起了重要的調(diào)控作用，其中IGFs被證明是胎兒生長(zhǎng)過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)因子［4］.IGFs是1957年發(fā)現(xiàn)的具有類(lèi)似胰島素原代謝活性和結(jié)構(gòu)特征的低分子肽類(lèi)物質(zhì)，它是一種具有同化作用的生長(zhǎng)因子，能增加葡萄糖和氨基酸的吸收，抑制蛋白質(zhì)降解，刺激各種細(xì)胞的增殖和分化［5］.

IGFI不僅可直接刺激胎兒的神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼、血液系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)等的發(fā)育，還可通過(guò)改善胎盤(pán)功能，調(diào)節(jié)胎盤(pán)血流轉(zhuǎn)運(yùn)，增加胎盤(pán)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取，從而促進(jìn)胎兒生長(zhǎng)［6］.本研究結(jié)果表明正常妊娠組IGFI的表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于胚胎發(fā)育終止組，且母血中IGFI的含量在正常妊娠組也顯著高于胚胎發(fā)育終止組，說(shuō)明胚胎發(fā)育早期IGFI蛋白保持較高的表達(dá)不但與早期胚胎的正常發(fā)育密切相關(guān)，而且還是維護(hù)正常胚胎和胎盤(pán)的生長(zhǎng)所必需.IGFII在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入、分化和胎盤(pán)形成過(guò)程中以自分泌方式發(fā)揮重要作用.在妊娠的前3mo，IGFII對(duì)早期合體滋養(yǎng)層增殖和（或）分化起自分泌調(diào)節(jié)作用，在孕6wk左右，IGFII即隨絨毛外合體滋養(yǎng)層滲透和侵入到母體蛻膜，提示IGFII可能在滋養(yǎng)層侵入中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［7］.Lpoez等［8］發(fā)現(xiàn)缺乏IGFII基因的裸鼠胎盤(pán)海綿體滋養(yǎng)層糖原合成與糖原細(xì)胞數(shù)量較正常組顯著下降，提示IGFII在胎盤(pán)中可調(diào)控糖原合成及糖原細(xì)胞的量，是糖原合成的重要調(diào)節(jié)器;人類(lèi)IGFII作用與其相似，如胰島素一樣刺激葡萄糖在胎盤(pán)的轉(zhuǎn)運(yùn)及合成，對(duì)胎盤(pán)的形成與功能有顯著影響，從而進(jìn)一步影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育.本研究結(jié)果表明正常妊娠組IGFII的表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于胚胎發(fā)育終止組，且母血中IGFII的含量在正常妊娠組也顯著高于胚胎發(fā)育終止組，說(shuō)明胚胎發(fā)育早期IGFII蛋白保持較高的表達(dá)不但與早期胚胎的正常發(fā)育密切相關(guān)，而且是早期胚胎發(fā)育是重要調(diào)節(jié)因子之一.

Somi等［9］學(xué)者發(fā)現(xiàn)整個(gè)妊娠期間胎盤(pán)組織分泌的IGFII量是IGFI的近10倍，而我們的研究與此不一致，IGFI，IGFII分泌量結(jié)果相當(dāng).提示在維持胎盤(pán)生長(zhǎng)過(guò)程中，IGFI和IGFII作用相似，檢測(cè)血中IGFI，IGFII的含量可能作為判斷胚胎發(fā)育狀況的一項(xiàng)客觀生化指標(biāo)，不僅可能用于胎兒在宮內(nèi)發(fā)育是否正常的監(jiān)測(cè)，也為應(yīng)用外源性胰島素樣生長(zhǎng)因子治療流產(chǎn)、早產(chǎn)和胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩（IUGR）等妊娠疾病提供了理論依據(jù).

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