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      石榴皮對紅細胞膜脂質保護作用

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      石榴皮對紅細胞膜脂質保護作用

      【摘要】目的研究石榴(PunicagranatumL.)皮提取物對紅細胞膜脂質過氧化損傷的保護作用。方法采用3種活性氧產生體系誘發脂質過氧化為實驗模型,設立模型對照組(MC)、正常對照組(NC)以及3個石榴皮提取物給藥組,觀察比較各組的丙二醛(MDA)含量。結果同MC組相比,三組石榴皮提取物對黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶系統、H2O2及UV照射3種方法引起的細胞膜脂質過氧化產物丙二醛(MDA)的生成增加均有抑制作用,且有一定的劑量依賴關系。結論石榴皮對自由基引起的細胞膜脂質過氧化損傷有保護作用。

      【關鍵詞】石榴;紅細胞膜;脂質過氧化

      Abstract:ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectofpomegranatepericarps(PunicagranatumL.)onlipidperoxidationdamageoferythrocytemembrane.MethodsModeloflipidperoxidationoferythrocytemembranewasmadebythreekindsofradicalsgenerationsystems,xanthine(Xan)xanthineoxidase(XO)system,H2O2,andUVlight.Observationwasmadeonthecontentofmalondialdehyde(MDA).ResultsComparedwithMCgroup,theincreasesofMDAcontentinthemembraneinducedbyXanXOsystem,H2O2orUVlightinallofthethreePunicagranatumL.groupwereinhibiteddosedependently.ConclusionPunicagranatumL.mayprotecterythrocytemembranefromthelipidperoxidativedamageinducedbyradicals.

      Keywords:PunicagranatumL;erythrocytemembrane;lipidperoxidation

      脂質過氧化發生在需氧細胞中,是分子態的氧與不飽和脂肪酸作用的過程;自由基被證明廣泛地參與脂質過氧化過程。細胞膜因富含飽和脂肪酸最易受自由基攻擊,自由基對細胞膜的損傷主要是產生脂質過氧化反應,引起膜結構和功能的改變,從而影響甚至損傷機體的功能而引起一系列疾病。如有報道指明活性氧自由基與哮喘、發熱、關節炎、帕金森綜合征、唐氏癥、癡呆等疾病的發生有關[1]。自由基清除劑作為抗氧化劑,可以防止脂質過氧化的發生,從而預防機體因自由基產生的病變。許多陸生植物的次級代謝產物都可以作為抗氧化劑,特別是帶有酚羥基的物質,如黃酮、鞣質、香豆素等[2,3]。

      石榴(PunicagranatumL.)是我國已知的最早的可食用的植物之一,在我國被廣泛的種植。我國5個最有影響的石榴產區分別是:山西臨潼、山東棗莊、安徽懷遠、四川會理、云南蒙自。石榴皮是石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木石榴的干燥果皮,在中藥中它被用來治療痢疾、細菌感染、腹瀉、寄生蟲病及出血等疾病。近來又有報道指出石榴皮還有殺精子[4]及抗淋球菌的作用[5]。因為石榴皮中主要含有鞣質,占總質量的10.4%~21.3%,多酚類化合物已被證明具有清除自由基的作用,所以石榴皮可能具有清除自由基而抗氧化的作用。

      本實驗用2種方法研究不同鞣質含量的石榴皮提取物對大鼠紅細胞膜氧化損傷的保護作用。脂質過氧化物可分解產生丙二醛(MDA),本實驗用MDA的量來衡量脂質過氧化的程度。實驗采用3個不同濃度的給藥組來研究抗氧化性和劑量的效應關系。

      1材料

      UV2800紫外分光光度計(Unico上海儀器有限公司);高速冷凍離心機(3K30Sigma公司);冷凍干燥機(ChristALPHA14);大白兔,武漢大學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(鄂)2003-0004;石榴皮(購自武漢市藥材公司,經武漢大學藥學院張洪教授鑒定為石榴科石榴屬石榴的果皮);黃嘌呤(Xan)和黃嘌呤氧化酶(XO)(Sigma公司);考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒和丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);其他試劑均為國產分析純。

      2方法

      2.1實驗藥物的制備

      稱取一定量石榴皮,粉碎,用3倍量的70%的丙酮在室溫下浸漬約6h,再超聲30min,濾取濾液。其殘渣再重復以上操作3次,將濾液合并,濃縮,冷凍干燥,制成粉末。

      2.2紅細胞膜的制備

      兔全血在0~4℃用低滲溶血法制備[6],膜蛋白含量用考馬斯亮蘭試劑盒測定,得膜蛋白濃度0.7778g/L。

      2.3XanXO體系誘導細胞膜脂質過氧化

      反應終體積為1.0mL。各取制得的紅細胞膜0.5mL,分別加待測藥物0.1mL(MC和NC組加pH7.4磷酸鹽緩沖液),置37℃水浴15min,再加1.0mmoL/L的Xan溶液0.3mL,0.4U/mL的XO0.1mL,立即將反應管置37℃水浴1h待測。對照組、空白組、0.3mg/mL劑量組、0.5mg/mL劑量組、1mg/mL劑量組都分別檢測12次。

      2.4UV照射誘導細胞膜脂質過氧化

      反應終體積為1mL,內含細胞膜0.5mL及不同濃度的藥物0.1mL(MC和NC組用pH7.4磷酸鹽緩沖液代替),再加入0.4mLpH7.4的磷酸鹽緩沖液,反應管置紫外燈下照射1h后待測(MC組在同樣溫度下靜置而不放在紫外燈下)。對照組、空白組、0.3mg/mL劑量組、0.5mg/mL劑量組、1mg/mL劑量組都分別檢測12次。

      2.5脂質過氧化物的檢測

      采用MDA試劑盒測定,測定過氧化脂質降解產物中的丙二醛(MDA)含量以反映脂質過氧化程度。

      2.6統計學處理

      MDA數值采用±s表示,多組資料間的兩兩比較用t檢驗,P<0.05為差異有顯著性。

      3結果

      3.1石榴皮對XanXO體系誘導兔血紅細胞膜脂質過氧化的影響

      圖1顯示,與對照組比較,0.3mg/mL劑量組的P值<0.05,0.5mg/mL、1mg/mL的劑量組的P值<0.01,說明石榴皮對XanXO體系誘導兔血紅細胞膜脂質過氧化產生的MDA的生成有明顯的抑制作用。

      (*P<0.05,**P<0.01vsmodel,n=6)

      圖1石榴皮對XanXO體系誘導兔紅細胞膜脂質過氧化的影響(略)

      Fig.1EffectsofP.G.extractonerythrocytemembranelipidperoxidationinducedbyXanXOsystem

      3.2石榴皮對H2O2誘導兔血紅細胞膜脂質過氧化的影響

      圖2顯示,與對照組比較,0.3mg/mL劑量組的P值<0.05,0.5mg/mL、1mg/mL劑量組的P值<0.01,說明石榴皮對H2O2誘導兔血紅細胞膜脂質過氧化產生的MDA的生成有明顯的抑制作用。

      (*P<0.05,**P<0.01vsmodel,n=6)

      圖2石榴皮對H2O2誘導兔紅細胞膜脂質過氧化的影響(略)

      Fig.2EffectsofP.G.extractonerythrocytemembranelipidperoxidationinducedbyH2O2system

      3.3石榴皮對紫外線(UVlight)誘導兔血紅細胞膜脂質過氧化的影響

      圖3顯示,與對照組比較,0.3mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL的劑量組的P值均<0.01,說明石榴皮對紫外線(UVlight)誘導兔血紅細胞膜脂質過氧化產生的MDA的形成有明顯的抑制作用。

      (*P<0.05,**P<0.01vsmodel,n=6)

      圖3石榴皮對UVlight誘導兔紅細胞膜脂質過氧化的影響(略)

      Fig.3EffectsofP.G.extractonerythrocytemembranelipidperoxidationinducedbyUVlight

      4討論

      氧自由基可多方面氧化細胞,如細胞中的脂質、蛋白及DNA。因為細胞膜由脂質雙分子層組成,所以細胞膜很容易被氧自由基攻擊而發生過氧化。這些過氧化過程會產生很多的產物,如乙醛、過氧化氫及自由基等。

      脂質過氧化過程會造成細胞膜的損傷[7],從而會對細胞的生命活動造成直接的損害。除此之外,過氧化物分解產物還會和細胞內物質發生次級反應,進一步損傷機體,可使DNA發生變異等[8,9]。脂質過氧化物是自由基作用于多不飽和脂肪酸的產物,其含量與自由基的濃度成正比。脂質過氧化物(LPO)在稀酸中加熱降解為丙二醛(MDA),MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合,形成紅色產物,該產物在532nm處有最大吸收峰。本試驗采用的MDA試劑盒可以準確地反映出亞細胞水平的脂質過氧化量[10]。

      本實驗為了觀察石榴皮提取液及其凍干粉對抗細胞膜脂質過氧化的作用,采用了2種誘導氧化損傷體系,分別通過不同的機制產生自由基:在XanXO系統中,Xan在XO的催化下產生了超氧陰離子自由基(O2-·):Xan+2O2+H2O→尿酸+O2-+2H+。近年有學者應用電子順磁共振(ERS)技術檢測到該體系有O2-·生成;而紫外線照射可使細胞膜懸液中的H2O2、O2和其它生物分子中的電子從低能軌道躍遷到高能軌道,稱為激發態分子,后者迅速分解成·OH、O2-·和生物分子自由基。本實驗采用的2個損傷體系[11]中產生的自由基種類和損傷機制是有一定差異的,但石榴皮均能抑制脂質過氧化的形成,說明它們的保護機制是多途徑的,是非特異性的自由基清除劑,其確切機理有待進一步研究。

      本實驗顯示,石榴皮提取液及其凍干粉可以顯著抑制MDA的生成,這表明它們有阻止自由基生成或是清除自由基的作用。從而進一步表明石榴皮提取物有抗氧化和保護細胞膜的作用。

      實驗數據表明,石榴皮提取物凍干粉較提取液有更強的抗氧化活性。這可能是因為凍干粉中的鞣質含量較高的原因,而鞣質在本實驗中是主要的抗氧化活性物質。但也不排除黃酮這種也有抗氧化的物質對實驗結果產生正面影響。

      本研究結果可能對由自由基引起的疾病的治療有一定的積極作用。石榴皮對自由基的作用,從本實驗看來并不是特異性的,所以還需要通過更多的動物體內外實驗進一步研究石榴皮的抗氧化活性。

      【參考文獻】

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