生殖支原體檢測方法

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自Tully[1]等1981年首次從非淋菌性尿道炎男性患者的尿道分泌物中分離培養出2株生殖原體（Mycoplasmagenitalun,Mg）以后，許多學者對Mg的生長特性、免疫學特性、分子生物學特性以及與疾病的關系等進行了大量的研究并建立了多種Mg的檢測方法，本文就Mg的檢測方法研究進展進行簡要綜述。

1分離培養法

1.1培養基培養[1,2]Mg對培養基要求極高且生長緩慢,培養較難,尤其是臨床標本中Mg的培養更不容易成功.Tully1981年建立了對醫學支原體具有重要意義的SP-4培養基.適合于Mg生長的SP-4培養基,不含醋酸鉈,含Mg代謝所需的葡萄糖及其它營養成份,最適pH為7.4-7.5,可通過加入0.8%Noble瓊脂或0.50.6%瓊脂而固體化,用于克隆菌株,觀察菌落,Tully等利用這種培養基,從13份尿道分泌物標本中分離培養獲得2株Mg,培養期約為50天.1996年Jensen等還報道了另一種適合Mg生長的培養基，即改良Friis肉湯培養基，11份PCR檢測Mg-DNA陽性的尿道分泌物標本中，有6份在其中呈陽性生長。

國內學者對SP-4培養基進行了改良。趙季文等[4]利用改良的SP-4培基從性病及性亂人群中分離Mg獲得成功，初代生長時間在30天以上，平均為37.83天，最長為55天。

1.2組織細胞培養法組織細胞培養支原體，可為支原體提供良好的類似體內的生長環境。早在60年代，Chanock等[5]報道了肺炎支原體（Mp）在組織細胞中的生長。90年代，Jensen等[3，6]開始嘗試用細胞培養法來進行Mg的繁殖，并借此在電鏡下觀察到Mg侵入細胞的過程以及在細胞內的定位。在PCR的監測下，Jensec發現在11分PCR檢測MgDNA陽性的尿道標本中，有9份適應在Vero細胞磁頭中增殖，經過多次傳代培養后轉入改良的FriisfF肉湯培養基中，有6份能繼續傳代生長，最終在瓊脂培養基中克隆獲得4株。Jensen認為，在分離獲得新的Mg菌株方面，細胞培養繁殖過程起到了三方面的作用，一是使臨床標本中的Mg逐漸適應在人工培養基中生長，二是增加了接種于支原體肉湯培養基中的支原體數量，三是提供持續的接種源。

2血清學方法

根據Mg的免疫學特性，人們建立了用檢測Mg抗體和檢測與鑒定Mg抗原的血清學方法。

Furr等[7]于1984年詳細報道了檢測Mg抗體的MIF技術。Moller等對31例未檢測出Ct和Mh血清抗體的急性盆腔炎患者，用MIF檢測Mg抗體，發現其中大約40%在發病后一個月內抗體滴度有4倍或4倍以上的改變。Taylor-Robinson等[9]報道應用間接MIF檢測NGU患者Mg抗體，認為間接MIF試驗是一種具有足夠敏感性、特異性和簡便易行的檢測方法。Jensen等曾用EIA檢測有尿道炎癥與無尿道炎癥狀的男性STD患者急性期血樣標本中Mg抗體，結果發現反應性較弱，且與Mp存在廣泛的交叉反應。

根據特異性抗體能阻止支原體的生長及代謝這一特性，可采用已知高價血涉及進行祖先生長及代謝抑制試驗以鑒別支原體[11]。趙季文等曾采用MIT鑒定所分離獲得的Mg菌株。

暴露于支原體表面的脂結合膜蛋白（lipid-associatedmembraneproteins,LAMPs是一種支原體種屬特異性抗原，具有高抗原性，且不同菌株的支原體，其LAMP抗體具有高度種屬特異性，與其它種屬無交叉反應[12，13]。）因此提取Mg的LAMP建立ELISA方法檢測Mg抗體，可消除Mg與Mp之間的交叉反應。

3分子生物學方法

DNA探針和聚合酶鏈反應（PCR）檢測Mg的方法，克服了前兩類檢測方法的弊端，為研究Mg與疾病的病因學關系提供了有力的手段。

3.1DNA探針技術1987年Hyman[14]用PUCB載體構建成Mg基因文庫，并從中篩選制備出特異性DNA探針，通過斑點雜交，可檢測僅含0.1ng的特異性支原體DNA，即105CFU。

3.2聚合酶鏈反應（PCR）技術PCR是一種新的基因診斷技術，靈敏度高，特異性強，且快速、簡便。1990年，PCR技術開始在醫學支原領域應用。

早期的引物多參照菌體末端特異性粘附蛋白的DNA序列而設計。Palmer等體外擴增Mg粘附蛋白的部分核苷酸序列，3株Mg均出現37bp的DN斷，并證明PCR技術可檢測到10-15g的mg-DNA，其引物序列的：

mg1:5’TGTCTATGACCAGTATGTAC3’

mg2:5’CTGCTTTGGTCAAGACATCA3’

1991年Jensen等[16]根據Mg的粘附蛋白基因設計合成了如下組引物：

mgPa-15’AGATGATGAAACCCTAACCCCTTGG3’

mgPa-15’GACCATCAAGGTATTTCTCAACAGC3’

mgPa-15’CCGAGGGGTTTTCCATTTTTGC3’

用MgPa-1和MgPa-3成功地擴增出Mg的281bpDN段，5個臨床分離株擴增出同樣的產生，而其他支原體和細菌均為陰性，用MgPa-2作探針，對擴增產物經SoutherneP印跡雜交，均為陽性，證明引物具有特異性，共檢出下降大約有50個Mg細胞。1993年Jensen等[17]又根據Mg粘膜蛋白基因設計了另一對引物，即：

mg粘附蛋白基因設計了另一對引物，即：

mgPa-476：5‘ATGGCGAGCCTATCTTTGATCCTTTAA3’

mgPa-903：5‘TTCACCTCCCCACTACTGTCCTAATGC3’

用來證實和補充引物MgPa-1和MgPa-3所擴增的結果，其擴增片段為453bp。研究發現，這兩對Mg粘附蛋白引物的敏感性完全一致。用這種方法檢測99例尿道炎病人的尿道拭子，結果17例Mg陽性，而用培養法無一例陽性。

1994年Jensen[18]擴增Mg粘附蛋白基因序列并測序表明：該序列在Mg條件之間有明顯異質性，為此，Jensen等學者根據原體屬性高度保守區域16SrRNA的基因序列，設計了種特異性PCR引物，以期檢測臨床標本中所有Mg的感染：其引物序列為：

Mg-1，5‘GAATGACTCTAGCAGGCAATGGCTG3’

Mg-2，5’ATTTGCTGCTCACTTTTACAAGTTGGCT3‘

4種臨床標本的實驗結果表明，Mg粘附蛋白的基因序列不相同，但其165rRN基因序列則是100%同源，將兩種引物PCR結合，還可在可疑陽性標本中檢測出10-50個Mg基因拷貝以下的Mg基因，即以16SrRNA基因為靶基因的PCR系統在保證長期特異性基礎上更為靈敏。

趙季文等[19]采用Palmer設計的引物，擴增mg37bpDN段，檢測三種人群的Mg，結果是性亂人群陽性率為25.26%，性病人群為12.33%，而健康人群為3.85%。孔繁榮等[20]采用Jensen設計的MgPa-1和MgPa-3，擴增Mg281bpDN段，檢測結果是性亂婦女Mg檢出率為10.2%，STD患者為4.0%。

1998年，糜祖煌等[2]研究報道了分別以Mg粘附蛋白和16rRNA基因為靶基因建立的二種套式PCR檢測技術，前者擴增生Mg的374bpDN段，后者擴增產生241bpDN段。套式PCR不僅提高了靈敏度，而且因采用兩對不同的引物，特性也進一步的得到提高。用這些法檢測40例女性STD患者，發現Mg陽性12例，陽性率30%，檢出陽性率均高于普通PCR法。

4小結

微生物感染診斷的“金標準”是培養法，然而Mg培養成功率極低，有待于對培養基進行進一步的研究和改良，以促進Mg在其中的生長；此外，將細胞株引入Mg的培養可能是一個較好的方法，有必要加強這方面的探索和研究。免疫學檢測方法因支原體種屬間易出現交叉反應以及對抗原、抗體純度要求較高而在實際應用上受到一定限制，若能研究建立快速、靈敏、特異的檢測臨床標本中Mg抗原的方法，則具有較大的實用價值。PCR技術是一個簡單而又直接的檢測Mg方法，正被日益廣泛地采用，主要用于Mg感染的早期診斷或急性感染的診斷及各種人群中Mg的流行病學研究。但在應用時應注意：①臨床標本中Mg含量低，DNA純度不夠，抑制物過多，TaqDNA聚合酶活性低均會引起假陰性，應進一步完善模板DNA的提取技術；②因PCR靈敏度極高，在整個操作過程中均應嚴格避免PCR產物的污染，以減少假陽性。

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