玻璃化冷凍在運動醫學關節軟骨的應用
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生物材料(細胞、組織、器官)脫離供體后實現長時間的保存很難。伴隨著低溫保存技術的不斷發展,學者們發現在深低溫環境中的離體生物材料會逐漸減緩其新陳代謝,嚴重的停止新陳代謝,因此能夠使其得以長期保存。玻璃化冷凍保存法自被人發明至今一直都是低溫保存領域內的專家所研究的焦點話題。由于科技進步,隨著研究技術的不斷發展和應用領域的不斷擴展,玻璃化保存技術和方法已廣泛地用于各種生物材料的低溫保存中。玻璃化冷凍保存技術里面所述的“玻璃化”是著眼于物理層面所定義的,即在短時間內降低液體的溫度,使其變成玻璃體(非晶體固態)。影響玻璃化保存的主要因素包括冷凍保護劑(cryoprotectiveagents,CPAs)的種類及濃度、降溫速率、升溫速率和儲存溫度等。要實現玻璃化的關鍵是需要極快的降溫速率和較高濃度的CPAs。當前一共有50多種冷凍保護劑是運用比較廣泛的,一共有3個類別。CPAs的的挑選是非常關鍵的,運用在玻璃化冷凍保存的CPAs濃度要比另外一些諸如程序性降溫的凍存工藝濃度更高。研究得知,CPAs溶液的濃度與在相同時間范圍內低溫保護劑所滲進軟骨內部的劑量呈現正向關聯,但CPAs的濃度越高,意味著對軟骨會造成越大的損傷,毒性非常大?？茖W分配CPAs,讓它不僅僅發揮其玻璃化與穿透性作用,而且還可以減輕冷凍保護劑對細胞可能造成的傷害。玻璃化冷凍保存技術為組織器官的長期保存提供更為廣闊的前景,玻璃化冷存工藝能夠使得原本生物細胞活性、完整性得以維持,抗原性得以縮減。如今,美國紅十字會已經對CPAs的成分表示了認可,允許運用其來保存人體組織器官,到現在,在人精子、紅細胞單核細胞、胰島等的保存中得以廣泛的運用。
2.1關節軟骨組織的玻璃化冷凍保存
運動醫學領域非常普遍的病變就包括了軟骨損傷與缺損,缺損后軟骨不具有較好的自身修復與重建能力,假若治療不及時,會使得軟骨出現嚴重的退變。關節軟骨包括了諸多細胞外基質(占據比重為98%~99%)與少部分的軟骨細胞,細胞外基質的成分包括水、膠原與蛋白多糖、糖蛋白與一些其他類別的蛋白。關節軟骨含有豐富的水分,占據了65%~80%的濕重比。關節軟骨不具有神經支配與血液、淋巴供應,相對來說它的細胞密度與活性都非常低,所以軟骨一直往往不會導致劇烈的免疫反應。因此,軟骨病變最長運用的修復手段就是關節軟骨移植。相關研究得知,假若并未對軟骨實施低溫處理,常溫狀態下軟骨只可以保存2h,軟骨在3h之后其排列出現紊亂,形成了非常多的裂隙；鮮活的軟骨移植物沒有廣泛的來源,會出現免疫排斥、移植軟骨易被吸收。因此如今很多的專家都將注意力集中在冷凍軟骨移植技術,期望妥善處理鮮活異體軟骨移植導致的各種問題。相關研究表明：通過玻璃化冷凍保存液對軟骨組織實施預處理保存之后,軟骨組織活性得以提升,在8周的時間內,其存活率高達74.5%,此外細胞基質成分有著優越的代謝活性,此方法的成效非常理想。相對于緩速梯度降溫這一方法,玻璃化法能夠將冷凍保存后軟骨細胞存活率得以明顯增強,軟骨基質內蛋白多糖穩定性得以保持,基質受到的損傷降低。通過玻璃化法對關節軟骨進行體外冷凍保存能夠獲得較為理想的效果,但其移植效果還要展開更深入地研究。
2.2肌腱組織的玻璃化保存
肌腱采用玻璃化冷凍保存,其細胞活性得到較好的維持,對于肌腱細胞外基質和膠原結構的損傷非常小,所以在移植處理之后的肌腱細胞有著較好的生物活性,其修復成效和鮮活的自體肌腱無異,但相對于自體組織來說,修復重建所耗費的時間較多。肌腱是一種低免疫的原性組織,肌腱細胞承擔其免疫抗原性的表達。Kagabu等在分析研究了卵巢玻璃化保存后,得知組織免疫原性會在此過程中顯著下降,可能的原理為：①低溫保存對異體抗原呈遞細胞產生了抑制。②細胞膜組織主要的相容性抗原會被濃度較高的玻璃化溶液浸透和滲透性脫水所改變,因此供體的免疫原性被縮減。1992年,異體肌腱移植開始在臨床運用。相關研究得知,玻璃化保存肌腱能夠使得肌腱組織抗原性得以下降,肌腱生物活性得以保存,相對于另外一些處理方法,移植后的痊愈速度更快,獲得世界眾多專家學者的贊許。
3小結與展望
玻璃化法冷凍保存細胞(精子、卵母細胞等)在臨床上已獲得普遍的運用,逐漸完善了對皮膚、神經、角膜、心臟瓣膜、血管、腎臟、卵巢等組織的玻璃化法保存技術。同樣,玻璃化冷凍法在運動醫學軟組織移植方面有廣闊的應用前景。目前,隨著技術的發展,自身組織工程軟骨修復技術雖已成功研發,但是臨床使用較少,費用也較昂貴,無法得到普及發展。性價比相對較高的異體組織移植技術因此得到不斷發展,同種異體軟骨、肌腱組織來源相對較廣,移植技術已相對成熟,玻璃化保存技術的發展可為其相應的組織庫保存提供技術保障,在組織修復中起到重要作用。關節軟骨的玻璃化保存方法非常便捷、高效,由于冷凍工藝與冷凍劑獲得了進一步發展,有效提升了其冷凍保存效果,發展前景非常廣闊。
作者：李昊 亓建洪 單位：泰山醫學院運動醫學研究所
