探究DN段的制備技術

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1概述

2代載體（YAC、BAC、PAC）YAC載體能夠攜帶的動物片段長度為900～1000kb；植物片段的長度為100～350kb，用YAC構(gòu)建的基因組文庫只需要較少的克隆就可以覆蓋整個基因組。Phan等利用電擊法將YAC轉(zhuǎn)入番茄中，并在番茄中獲得了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細胞系，Adam等［5］、Flynn等［6］將同樣的方法應用在煙草中，但是YAC的穩(wěn)定性差、操作不便、具有自身難以克服的缺點［7－8］。BAC載體能攜帶的外源dnA長度為100～350kb，容量沒有YAC大，但相比之下BAC擁有更多的優(yōu)點。Choi等用pBACwich載體構(gòu)建了棉花的BAC文庫，并利用基因槍法使一部分克隆轉(zhuǎn)化到煙草中，證明了外源DNA片段可整合到染色體的特定位點上。Song等將從高粱中獲得的90kb的BAC克隆利用基因槍法成功轉(zhuǎn)入到玉米中，并在玉米后代中檢測到外源基因的高效表達。Ioannou等構(gòu)建了1個P1載體（pCYPAC－1），并通過電穿孔法將重組DNA轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中。這個新型的克隆載體能夠承載平均大小為130～150kb的片段，并且沒有明顯的嵌合和缺失現(xiàn)象，因此可以用來繪制物理圖譜和分析復雜的基因組。日本水稻基因組計劃就是用PAC文庫構(gòu)建的物理圖譜。Hamilton等［設計了1個既可以承載重組質(zhì)粒又可以轉(zhuǎn)化植物的載體即雙元細菌人工染色體（BIBAC），這一載體可將大片段轉(zhuǎn)入植物中，并成功的將150kb的人類基因組DNA通過農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)入到煙草中，通過對轉(zhuǎn)化煙草后代的鑒定發(fā)現(xiàn)此外源基因可以穩(wěn)定的遺傳表達。Hamilton等［構(gòu)建了世界上第1個番茄的大片段BIBAC文庫。大片段的基因組文庫的構(gòu)建，使很多全長基因的篩選和獲得均成為可能。目前，已知的以BIBAC為載體構(gòu)建的文庫有煙草、番茄、擬南芥、水稻、藥用野生稻、大豆及人參。這一載體是大片段DNA轉(zhuǎn)化植物最為有用的載體。可轉(zhuǎn)化人工染色體（TAC）為加快從植物基因分離定位克隆，這就要求載體系統(tǒng)要適應于染色體步移和遺傳互補，因此，Liu等構(gòu)建了可轉(zhuǎn)化的人工染這一載體系統(tǒng)能夠保證大片段DNA在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中都保持穩(wěn)定，并運用這一載體獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥以及轉(zhuǎn)基因水稻，這一載體的出現(xiàn)彌補了YAC、BAC在定位克隆研究中的缺陷。

2大片段DNA制備技術

通過使用96孔板作為提取容器，將研磨后的植物樣本放入不同孔中進行提取，1人1d可提取近千個樣本。大片段DNA遺傳轉(zhuǎn)化的方法及其影響因素當前根據(jù)有無載體可將轉(zhuǎn)化方法分為2類：1類是以質(zhì)粒DNA等為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，即將目的基因插入到農(nóng)桿菌的質(zhì)粒等載體上，伴隨著質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移將目的基因轉(zhuǎn)入到植物中，如葉盤法、原生質(zhì)體法、真空滲入法、脂質(zhì)體法等；另1類為不需要載體的轉(zhuǎn)化方法，如基因槍法、花粉管通道法、電擊法、微注射法、聚乙二醇法、硅化纖維法等。1982年通過農(nóng)桿菌介導的方法獲得了全世界第1株轉(zhuǎn)基因植物煙草，這標志著轉(zhuǎn)基因時代的全面到來。目前農(nóng)桿菌介導法應用依然最廣，在獲得的百余種轉(zhuǎn)基因植物中，有80％是通過農(nóng)桿菌介導的方法獲得的。菌種和宿主范圍農(nóng)桿菌菌株種類很多，每種菌種所具有的毒力也就是侵染能力各不相同，因此每種菌種都有其適宜侵染的最適合宿主。一般而言，農(nóng)桿菌菌種侵染能力強弱依次為農(nóng)桿堿型菌株、胭脂堿型菌株、章魚堿型菌株。農(nóng)桿菌堿型菌株有EHA胭脂堿型菌株有C58、GV3101，章魚堿型菌株有LBA4404、Ach5，選擇對受體植物較為敏感的菌株是轉(zhuǎn)化成功的重要因素。同一種植物對不同菌株的敏感程度也不相同，如Hiei等在對水稻的研究中發(fā)現(xiàn)，EHA101（pTOK233）不如LB4404（pTOK233）效果好；在西瓜中，EHA105的侵染能力明顯優(yōu)于LBA4404和AGL－1，轉(zhuǎn)化率可達76．7％。農(nóng)桿菌宿主范圍廣泛，可轉(zhuǎn)化許多雙子葉植物、單子葉植物和裸子植物，此外，農(nóng)桿菌也可以轉(zhuǎn)化真菌，如酵母、子囊菌和擔子菌。近期的報道農(nóng)桿菌將DNA轉(zhuǎn)化到了人類細胞。

作者:石玉蔣世翠張美萍孫春玉王康宇王義單位：吉林農(nóng)業(yè)大學