螯蝦基因論文：螯蝦Y - box基因的復制與分析

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本文作者：孟慶國1陳靜1黃艷青2靳明建3顧偉1王文1作者單位：1南京師范大學生命科學學院2中國水產科學研究院東海水產研究所

材料與方法

1實驗材料

實驗動物:健康紅螯螯蝦購自南京某養殖場，體重10～20g，于室內水循環系統中暫養(通氣、換水)，水溫24～26℃，每天投喂飼料。實驗試劑:Trizol試劑為Invitrogen公司產品;普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和pMD－18T載體等均為TaKaRa公司產品;SMARTTMcDNAlibraryconstructionkit和SMARTTMRACEcDNAAm-plificationKit購自Clontech公司，其它試劑為國產分析純。大腸桿菌DH5由本實驗室保存。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2總RNA提取和cDNA文庫構建

2mL一次性注射器抽取紅螯螯蝦血淋巴，迅速與等量的抗凝劑混合(葡萄糖05g;檸檬酸0.8g;氯化鈉0.42g;雙蒸水定容至100mL)，2000g、4℃離心樣品10min以收集血淋巴細胞。參照Trizol試劑操作提取總RNA，測定RNA的濃度和純度，2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。按照SMARTTMcDNAlibraryconstructionkit說明書構建紅螯螯蝦血淋巴細胞cDNA文庫。合成雙鏈的cDNA連接到pMD－18T載體中，轉化到E.coliDH5感受態細胞中，經PCR鑒定為陽性克隆后送華大公司測序。測序得到序列經BLAST比對后得到紅螯螯蝦的冷休克YB基因的部分序列。

3RACE及全長序列的獲得

根據已經得到的冷休克YB基因的部分序列設計5''''和3''''RACE引物(表1)。在進行5''''和3''''RACE反轉錄時，YB5R和NUP引物用于擴增5''''端，YB3F和NUP引物用于擴增3''''端。RACE步驟按照SMARTTMRACEcDNAAmplificationKit說明書進行。擴增得到的片段純化并連接入載體后送華大公司測序。根據已獲得的全部cDN段，設計引物YB－ORF－F和YB－ORF－R擴增YB基因的開放讀碼框。

4序列分析

在NCBI網站，進行相似性搜索，下載其他物種冷休克Y－box蛋白的序列。通過ORFFinder找到紅螯螯蝦冷休克Y－boxcDNA序列的開放讀碼框，并推導出其氨基酸序列，用ComputepI/Mw和Interproscan等工具分別預測相對分子質量、等電點和功能域，用ClustalW同源性分析，用MEGA軟件構建系統進化樹，冷休克Y－box蛋白的三級結構預測用SWISS－MODEL。

5Real－timePCR分析

使用Trizol分別提取3尾紅螯螯蝦肝臟、腸、鰓、心臟、血淋巴、神經和肌肉總RNA，以OligodT和隨機引物合成cDNA第一鏈，根據已獲得的紅螯螯蝦的冷休克YB基因全長序列設計引物YB－RT－F和YB－RT－R，同時以紅螯螯蝦β－actin基因序列(GenBank:AY430093)為內參設計引物β－actin－F和β－actin－R，對各組織冷休克YB基因的表達進行定量分析，擴增條件同為94℃預變性30s后，94℃5s、60℃30s進行40個循環。PCR結束后對擴增產物進行溶解曲線分析，以確保特異性擴增。每個樣品設3個重復，以未加模板的PCR反應樣品作為陰性對照。不同組織中的冷休克YB基因相對表達水平用2－△△CT方法(△△Ct=(Ct目的基因－Ct管家基因)實驗組－(Ct目的基因－Ct管家基因)對照)進行計算，數據分析采用t測驗方法(SPSS軟件)，當P＜0.05時被判定為差異顯著。

結果

1紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因的克隆和氨基酸序列分析

紅螯螯蝦的冷休克YB基因全長cDNA由1733bp組成，其編碼區有975bp，編碼324個氨基酸。在起始密碼子ATG的上游有82bp非翻譯區，終止密碼子TAA的下游有包含polyA在內的676bp非編碼區序列(圖1A)。紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白的預測等電點和相對分子質量分別為9.81和35800。

2紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白氨基酸序列比對和系統進化分析

通過序列比對和相似性分析，紅螯螯蝦冷休克與其他物種的冷休克Y－box蛋白有一定的相似性，特別是在前部(20－98AA，冷休克結構域)具有非常高的相似性，此部分為此類蛋白重要的功能域(冷休克蛋白保守位點和核酸集合功能域)(圖2)，而其他部分(富含丙氨酸或脯氨酸的區域、帶電荷區域，圖1B)的相似性較低。通過ClustalW軟件分析和MEGA軟件構建冷休克Y－box蛋白的系統進化樹，紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白與水蚤的冷休克Y－box蛋白進化關系最近，并與昆蟲等其他節肢動物冷休克Y－box蛋白聚為一支(圖3A)，而與脊椎動物冷休克Y－box蛋白序列(同樣聚為一支)進化關系相距較遠。應用SWISS－MODEL預測了紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白的三級結構，并與D.pulex冷休克Y－box蛋白的三級結構進行對比，發現它們的結構非常相似(圖3B和C)。

3紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因的組織表達分析

使用Realtime－RT－PCR方法對紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因在各組織中的轉錄情況進行研究，結果顯示，冷休克Y－box蛋白基因轉錄活性最強的組織是神經，而后依次為肝臟、血淋巴和鰓，在腸和心臟中也有活性，在肌肉組織中轉錄保持較低水平(圖4)。

討論

本研究克隆的紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因cDNA開放讀碼框為975bp，推測的蛋白質324個氨基酸。與其他冷休克Y－box蛋白一樣，紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白也由三部分結構域組成(富含丙氨酸或脯氨酸的區域、冷休克結構域和帶電荷區域)，其中20－98AA為冷休克結構域，此部分具有很高的保守性，與脊椎動物(哺乳動物、鳥類、魚類等)和其他無脊椎動物(軟體動物、昆蟲等)的相似性都在80%以上。因此，作為第一個發現的經濟水生甲殼動物的冷休克Y－box蛋白，其具有與其他動物冷休克Y－box蛋白相似的特征。通過冷休克Y－box蛋白氨基酸序列遺傳進化分析，發現紅螯螯蝦與另外一個甲殼動物———水蚤的進化關系最近，且與昆蟲等節肢動物聚為一支，而其他脊椎動物、軟體動物等聚為一支，這也基本上與傳統的動物系統發生分類次序吻合。本研究還預測了紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白的三級結構，發現其三級結構與其他動物冷休克Y－box蛋白的三級結構非常相似，特別是冷休克結構域部分都是由六個相同的β－折疊組成，只是在蛋白的N端有一部分結構有差別。由于目前發現的冷休克Y－box蛋白較少，且報道的相關研究對象都是人、鼠等模式動物。而本研究中發現的冷休克Y－box蛋白來源于甲殼動物。無脊椎動物和脊椎動物在器官分類上有較大的差別，加之有關無脊椎動物冷休克Y－box蛋白基因組織分布也未見報道，所以目前只能對不同的動物種類冷休克Y－box蛋白基因的組織分布做直觀描述，無法進行不同物種之間相關信息的對比。研究了紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白在不同組織中的分布，發現紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因轉錄活性最強的組織是神經，這可能與在對冷刺激敏感相關，也可能與神經在信號傳導和內分泌調劑中的重要作用相關［18－20］，紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因在心、腸和肌肉中的表達量很低。在非洲爪蟾中，卵巢和睪丸中冷休克Y－box蛋白基因轉錄活性最強，而后依次是輸卵管、腎、心、肝和皮膚［21］。在小鼠中也是睪丸中冷休克Y－box蛋白基因轉錄活性最高，而后其次是肌肉、腎、脾、心和卵巢，肝和血中幾乎沒有表達［18］，還有人發現小鼠冷休克Y－box蛋白基因轉錄活性的順序為睪丸、腎、心、脾、肌肉、肝和腦［22］，以上證明冷休克Y－box蛋白在動物睪丸中表達最高，表明其在精子發育中起到非常重要的作用［18，21－22］。由此看出冷休克Y－box蛋白基因在不同動物心和肌肉中的表達量均較低，而在與內分泌相關的組織如卵巢、睪丸等中表達量較高。然而，此前關于Y－box蛋白在其他動物組織中的分布情況研究都沒有涉及神經組織，所以本研究為其他動物Y－box蛋白在組織中的分布研究提供了新的思路，即除了關注肌肉、腎、脾、心、肝和生殖系統的組織外還需要關注神經組織，也許神經組織在這些動物中也是Y－box蛋白的高表達區，而與神經相關聯的內分泌系統可能在參與冷休克蛋白的功能表達和信息傳遞中起重要作用。本研究首次克隆的到了紅螯螯蝦冷休克Y－box蛋白基因，對其組織表達進行了研究，并發現該蛋白在神經中的高表達現象，為下一步深入開展該蛋白的功能及其與其相關的生理調節機能研究奠定了基礎。