動物行為學方法
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動物行為學方法范文第1篇
【關鍵詞】 燈盞花素 再灌注損傷 行為
［ABSTRACT］Objective To investigate the effect of breviscapine on the ethological index after cerebral ischemia/reperfusion in gerbils. Methods A cerebralischemiareperfusion model of gerbils was established， ischemia time being 10 minutes. Gerbils were randomised to shamgroup， control group and breviscapine group. They were further pided into four subgroups， eight in each group. Reperfusion was carried out in the latter two groups， which lasted for 1， 2， 4， and 7 d， respectively. The ethological index of gerbils was counted by the open field method after reperfusion. The brain temperature in all gerbils was kept at(37.2±0.2) ℃ during the experiment. Results After different time of reperfusion， the score of ethological index in control group was higher than that in shamgroup， that in breviscapine group was higher than shamgroup， but was lower than control group. Conclusion Breviscapine could reduce cerebral ischemia/reperfusion injury in gerbils by attenuating the changes of the behavioral marks.
［KEY WORDS］ Breriscapine; Reperfusion injury; Behavior
腦缺血再灌注損傷及其防治的研究一直為國內外學者所關注，至今未獲得重大進展。低溫具有確切的腦保護作用，但其本身存在諸如增加血黏度、干擾微循環、引起心律失常等副作用。燈盞花素注射液是一種中成藥，具有蛋白激酶C（PKC）抑制作用，同時具有降低血黏度、改善微循環之功效。有研究表明，燈盞花素可減輕腦缺血再灌注損傷。本研究就燈盞花素對沙土鼠腦缺血再灌注后相關行為學指標的影響做進一步探討。
1 材料與方法
1.1 動物模型制作
沙土鼠24只，體質量(50～70)g，雌雄不拘。戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，將動物俯臥于手術臺上，自頭頂部切開皮膚，于矢狀縫外2 mm、前囟后2 mm處，用細鉆鉆洞（不鉆透腦膜），置入自制電極，用牙托粉固定。電極接多功能腦電監護儀監測腦電圖，以判斷是否造成沙土鼠前腦缺血。然后將動物仰臥于實驗臺上，切開頸部正中皮膚，仔細分離雙側頸總動脈，用無創動脈夾阻斷頸總動脈造成前腦缺血，松開動脈夾恢復腦血流即為再灌注[1，2]。腦缺血時間10 min。假手術組僅游離雙側頸總動脈但不予阻斷。各組動物在腦缺血再灌注期間均將其放入恒溫箱中，以使腦溫控制在（37.2±0.2）℃。
1.2 動物分組
將動物隨機分為假手術組、對照組和燈盞花素組，每組8只動物，后兩組再根據再灌注時間分為再灌注1、2、4、7 d等4個亞組。燈盞花素組于腦缺血前30 min和再灌注后6 h時腹腔注射燈盞花素注射液90 mg/kg（云南省生物制藥廠），假手術組和對照組動物在相同時間點注射等容量的生理鹽水。
1.3 相關行為學指標檢查
沙土鼠腦缺血再灌注后1、2、4和7 d應用開闊法觀察其行為學變化，開闊法檢查所用的迷宮尺寸為76 cm×72 cm×57 cm，劃分為25個方格。檢查時將沙土鼠放于正中格中，記數其10 min內爬過的格子數。每次檢查時保持房間安靜和室內燈光強度一致。
1.4 統計學處理
數據均以±s表示，組間比較采用t檢驗。
2 結 果
沙土鼠腦缺血再灌注后1、2、4和7 d，假手術組行為學評分為244±51，對照組行為學評分明顯高于假手術組（t=5.399～11.372，P
3 討 論
沙土鼠因缺乏Willis動脈環，阻斷雙側頸總動脈可造成前腦缺血，故被廣泛應用于腦缺血的實驗研究。但近來的研究發現，部分沙土鼠存在解剖學變異，阻斷雙側頸總動脈不易造成前腦缺血[3]。
燈盞花素注射液是從云南燈盞花全草中分離所得，其主要成分是黃芩素甙。有研究表明，燈盞花素具有PKC抑制作用[3]，同時其還可降低血黏度、改善微循環。另有研究表明，燈盞花素可減小大腦中動脈阻斷后皮質梗死灶的體積，減輕腦缺血再灌注損傷[4～6]。
開闊法是檢查沙土鼠腦缺血后神經功能障礙的常用方法之一。海馬在維持動物的學習、記憶和空間定位能力等方面發揮著重要作用，當海馬功能受損時，表現為探索活動活躍。海馬對腦缺血特別敏感，短暫的腦缺血即可造成海馬神經元死亡。本實驗結果顯示，沙土鼠腦缺血10 min再灌注1、2、4和7 d后，對照組的行為學評分明顯高于假手術組，提示腦缺血引起海馬神經元功能受損，導致沙土鼠探索活動次數增加。而缺血前應用燈盞花素沙土鼠行為學評分盡管高于假手術組，但明顯低于對照組，證實燈盞花素可減輕腦缺血再灌注損傷。
【參考文獻】
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動物行為學方法范文第2篇
【關鍵詞】神經病理性疼痛；脊髓背角；P物質
The increase of substance P expression in dorsal horn of spinal cord in rats with chronic constriction nerve injury
ZHANG Rui,WANG Qing-xiu,GUO Hui-qing，et al.Department of Anesthesiology,affiliatedDongfeng Hospital of Shiyan YunYang Medical College,Hubei，442008,China
【Abstract】 Objective To observe the expressive variety of substance P in the dorsal horn of spinal cord on neuropathic pain by chronic constriction injury(CCI).Methods Sixty male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups:CCI group,control group.Record the responsiveness to mechanical and thermal stimuli before and after sciatic nerve constriction injury.Immuno-histochemistry technique was used to measure the expression of substance P in the dorsal horn of spinal cord at 3th,7th,14th,28th days following sciatic nerve constriction injury.Results The rats’ responsiveness to mechanical and thermal stimuli and pain behavior were significantly increased on postoperative days after sciatic nerve ligation compared with preoperative(P
【Key words】Neuropathic pain；Dorsal horn of spinal cord；Substance P
疼痛性疾患是困擾人類健康的嚴重問題，其中慢性疼痛是常見的病理痛之一,在慢性疼痛中，神經源性痛(neuropathic pain)的治療至今仍缺乏有效的治療手段，其機制也未能完全闡明，是臨床面臨的一大難題[1] 。P物質(substance P,SP)是速激肽家族中重要一員，廣泛分布于中樞神經系統和外周組織中。在脊髓，P物質是公認的與傷害性信息傳導密切相關的神經活性物質[2]，本實驗旨在觀察坐骨神經慢性壓迫性損傷(CCI)后大鼠痛行為學改變和脊髓背角SP 含量變化,探討SP 在CCI后可能的作用。
1 材料與方法
1．1 對象 本實驗在鄖陽醫學院實驗中心及動物中心完成。成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只(鄖陽醫學院實驗動物中心提供)，體質量150~200 g。
1．2 CCI［坐骨神經慢性壓迫性損傷］模型的建立 按Bennett 等的方法,SD大鼠水合氯醛腹腔麻醉(30~40 mg/kg)后,常規消毒右下肢,找到坐骨神經主干,用4-0鉻制羊腸線松扎四處,間距為1 mm,結扎線以不影響神經外膜的血運為度。術畢立即腹腔注射青霉素20萬U。
1．3 動物分組及觀察指標 SD雄性大鼠60只,隨機分為:A組：CCI組(30只)； B組：對照組(30只)，對照組除坐骨神經不結扎外，其他操作同CCI動物。
觀察指標：于術前、術后3、7、14、28 d 測定大鼠熱痛閾、機械痛閾值及行為學評分。于術后3、7、14、28 d 每組取3只，麻醉后麻醉后用4%多聚甲醛灌注固定，取L4-6段脊髓，以備免疫組化，測定SP的變化。
1．4 動物疼痛行為學測定
1．4．1 整體行為學評分 參照Attal等的評分方法,通過觀察動物行為及損傷側爪部姿勢判斷自發性疼痛程度。
1．4．2 機械痛閾的測定 采用YLS-3E 電子壓痛儀(正華公司,中國)測定雙后肢機械痛閾。設定增量壓力10 g/s。大鼠放在有機玻璃框架中,待鼠安靜,探針對準大鼠后足掌心，啟動開始鍵，至大鼠嘶叫，記錄該刻值，即為機械痛閾閾值。術側與健側各測量5次,每次間隔5 min，取平均值。
1．4．3 熱痛閾的測定 采用ZH-LUO/B輻射光熱測痛儀(正華公司,中國)測定大鼠足底熱痛閾。設定輻射熱強度：49 I.R；實際照度：180 mW。記錄輻射照射開始到抬足的時間，該時間即為熱痛閾。單次光照射時間不超過30 s，間隔5 min，術側與健側各測定5次，取平均值。
1．5 脊髓背角SP的免疫組織化學測定及分析
①石蠟冠狀切片，脫蠟入水，3％H2O2室溫孵育10 min，蒸餾水洗3 min×3次；
②微波爐(中檔)修復3 min，室溫冷卻60 min，蒸餾水洗3 min×3次，0．01 mol/L,pH 7．4 PBS漂洗3 min×3次 ；
③滴加 3％H2O2 水溶液，室溫15 min，蒸餾水洗3 min×3次，0．01 mol/L,pH 7．4 PBS 漂洗3 min×3次 ；
④滴加30 μl正常羊血清，室溫孵育15 min；
⑤甩掉血清，滴加30 μl 1:100 SP抗體，空白對照片加30 μl抗體緩沖稀釋夜,濕盒內4℃過夜；
⑥0．01 mol/L,pH 7．4 PBS 漂洗3 min×3次；
⑦滴加鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶(HRP-Streptavidin)，室溫孵育15 min；
⑧0．01 mol/L,pH 7．4 PBS 漂洗3 min×3次；
⑨DAB溶液(用前現配)染色3~5 min；
⑩自來水充分沖洗；
B11蘇木素復染1~2 min；
B12自來水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片；
B13應用Geica QwinV3圖像分析系統進行計算機圖像分析處理，選用免疫陽性反應物的累積光密度值進行統計分析。
1．6 統計學方法 用Excel和SPSSv13．0軟件進行統計學分析，實驗結果以均數±標準差”(x±s)表示。組間比較采用成組t檢驗，組內比較用配對t檢驗進行分析，P
2 結果
2．1 疼痛整體行為學評分 A組大鼠從術后第3天起,行為學評分明顯高于對照B組，第7天最明顯，組間差異具有統計學意義(P
2．2 機械痛閾值與熱痛閾值變化 機械痛閾值與熱痛閾值術后各時間點A組均顯著低于對照B組(P
2．3 脊髓背角SP的表達免疫組織化學結果表明，手術側脊髓后角，A組術后術側明顯高于B組(P
3 討論
在脊髓，P物質(substance P,SP)是公認的與傷害性信息傳導密切相關的神經活性物質[2]，含有它們的初級神經纖維及末梢主要終止于脊髓背角淺層，并與接受傷害性刺激的投射神經元形成直接或間接的聯系[3]。SP不僅傳遞傷害性信息,而且在脊髓痛覺調制中具有重要作用[4]，它與興奮性氨基酸一起介導傷害性初級傳入向脊髓背角的傳遞[5]，近年來體微電極技術可精確定位刺激引起的SP在脊髓背角釋放[6]。Yezierski [7]等證明SP與脊髓損傷后的中樞性疼痛有關。在活體，激活了C纖維后，許多神經肽類物質釋放，如SP、CGRP、血管活性腸肽VIP、生長抑素和谷氨酸[8]，這些遞質遞質作用于受體后，改變疼痛行為。SP作用于突觸后膜NK1受體，加強傷害性信號傳遞。神經激肽NK1與NK2受體是傷害感受中最重要的受體[9],當脊髓內同時注射SP和谷氨酸時，產生顯著的，相互增強的致痛反應[10]。神經損傷后，C纖維興奮性增加，SP大量釋放，作用于脊髓背角的NK1受體，NK1受體激活后，激活磷脂酶C，使細胞內的三磷酸肌醇IP3和二酰基甘油DAG的濃度增加。IP3動員內質網內的Ca2+儲庫，使細胞內游離Ca2+的濃度增加,使NMDA受體激活。在L5、L6脊神經結扎前、后損傷NK1受體表達神經元，能減輕神經源性痛，說明NK1受體神經元參與背角神經元的敏化[11]。
外周神經損傷常引起慢性神經病理性疼痛，表現為持續自發性疼痛和痛覺過敏，外周和中樞的敏化是其病理基礎。本研究顯示CCI大鼠于術后3 d出現疼痛行為學變化和熱刺激痛覺過敏、機械性痛敏，7 d達高峰，在后續較長的時間內維持穩定，表明形成了較為典型的神經病理性痛；在疼痛產生的不同時間點，觀察SP的表達變化，本研究發現CCI后術側脊髓背角SP與對照組比均明顯升高，術側明顯高于健側(P
參考文獻
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動物行為學方法范文第3篇
關鍵詞：針灸療法 抑郁癥
抑郁癥是一種常見的情緒障礙性疾病，表現為一種持久的抑郁狀態，以心境低落、軀體不適和睡眠障礙等為主要癥狀［1］。是危害全人類身心健康的常見病，其終生患病率為6.1%～9.5%［2］。據專家預測，到2020年，精神疾病在人們的疾病負擔中將列首位，而抑郁癥則占精神科疾病的47%［3］。抑郁癥及其治療引起內外廣大學者的廣泛重視。本研究旨在通過觀察針刺對抑郁模型大鼠行為學的影響，評定針刺抗抑郁療效。
1 器材
1.1 藥品多慮平：南京白敬宇制藥廠產品，批號：20040912。
1.2 動物（200±20）g Wistar雄性大鼠，由山東大學實驗動物中心提供，合格證號：魯動質字：20040816。
1.3 器材“華佗”牌32號1.0寸針灸針，蘇州醫療用品廠產品；穿梭箱：山東中醫藥大學中西醫結合基礎研究室提供，根據文獻介紹制備［4］，大鼠穿梭箱有兩室，每室30 cm×30 cm× 20 cm，可人為開閉，箱底為不銹鋼柵條，條間距離為1 cm，兩室柵條可錯時通電，一室與刺激器接通時，另一室為安全室；敞箱：根據文獻介紹，自行制備［5］，標準為40 cm×80 cm×80 cm，周壁、底面為黑色，底面以白線劃分為面積相等的25塊。
2 方法
2.1 模擬臨床建立大鼠學習無助模型將大鼠放入穿梭箱，中間通道關閉，通過底部的金屬柵條給予220V，0.8 mA的方波刺激，刺激15 s，間隔45 s/次，共60次，總刺激時間15 min，進行不可逃避的電休克即前休克動物（pre-shocked animals）制作［1］。
2.2 分組及給藥(200±20)g Wistar雄性大鼠40只，按體重均衡隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性藥多慮平組、針刺組，每組10只。空白組及模型對照組分別給予涼開水1 ml/100 g，ig；多慮平對照組給予多慮平3 mg/kg，生理鹽水配成30%水溶液1 ml/100g·ig ；空白對照組大鼠只放入穿梭箱內而不進行電刺激，時間相同。第2天除重復進行前一天實驗并開始給藥，連續給藥14 d。最后一次給藥后24 h，采用Open-Field法進行動物行為學敞箱實驗及條件回避實驗，記錄并統計實驗數據。
2.3 針刺取穴及操作方法針刺組根據《實驗針灸學》［6］大鼠穴位定位方法，選擇百會、內關、神庭、三陰交穴，并參照人和動物的穴位解剖結構特點，在動物針灸穴位圖譜的基礎上，于大鼠前正中線上，額頂骨縫交界線前方處定位神庭穴。其他穴位仿人取穴。針刺方法: 穴位常規消毒，百會穴向前斜刺，神庭穴向上斜刺，進針深度約為0.2 cm。內關直刺0.3 cm，三陰交直刺0.2 cm。每穴行均勻捻轉刺激30 s，留針10 min,每日治療1次,連續14 d。最后一次治療后24 h，采用Open-Field法進行動物行為學敞箱實驗及條件回避實驗，記錄并統計實驗數據。
2.4 敞箱實驗將各組大鼠依次放入自制敞箱，以動物穿越底面塊數為水平運動（crossing）得分，直立次數為垂直運動（rearing）得分，記錄其水平運動、垂直運動次數，每只動物測定1次，測定時間為3 min/次，記錄水平運動得分和垂直運動得分情況。
2.5 條件回避實驗（conditioned avoidance testing）繼敞箱實驗后，大鼠放入穿梭箱后適應5 s，進行鈴聲刺激，非條件刺激為足電休克0.8 mA，在鈴聲響起3 s后開始方波輸出電刺激，當動物逃到安全室后停止鈴聲和刺激，如未能逃避時刺激達30 s時停止。1次/min，共進行30次，刺激間隔為27 s。測定回避成功次數和逃避潛伏期。 動物在鈴聲開始3 s內逃到安全室，記錄回避成功一次，逃避潛伏期為0；刺激后才逃避的，其潛伏期記錄是從刺激開始到逃避完成的時間；到最后未能逃避的，則潛伏期為30 s。
2.6 統計學處理所有實驗數據用 ±s表示，計量資料采用t檢驗、q檢驗進行差異顯著性檢驗；計數資料采用四格表的確切概率法檢驗。
3 結果
3.1 針刺對學習無助模型大鼠敞箱實驗的影響
3.1.1 水平運動針刺組、多慮平組、空白組均優于模型組。結果見表1。
表1 對大鼠水平運動的影響（略）
為避免統計學上第2類錯誤，出現假陽性結果，本組數據采用q檢驗。結果見表2。
表2 q檢驗結果（略）
由此可見，空白組與模型組有顯著性差異，說明此造模方法成功；針刺組及多慮平組與模型組有顯著性差異，其差異具有統計學意義；而前兩組與空白組的差異及前兩組間的差異不具有統計學意義，說明針刺與多慮平均有改善抑郁模型大鼠水平運動狀態的作用，且二者作用相似。
3.1.2 垂直運動各處理因素對實驗動物垂直運動的影響無顯著差異。結果見表3。
表3 對大鼠垂直運動的影響（略）
為避免統計學上第2類錯誤，出現假陽性結果，本組數據采用q檢驗。結果見表4。
表4 q檢驗結果（略）
由此可見，各處理因素對大鼠的垂直運動的影響無統計學意義。
3.2 針刺對學習無助模型大鼠條件回避實驗（conditioned avoidance testing）的影響
3.2.1 回避成功空白組、多慮平對照組、針刺組大鼠，回避成功次數較多。結果見表5。
表5 回避成功次數（略）
本組數據采用q檢驗。結果見表6。
表6 q檢驗結果（略）
動物行為學方法范文第4篇
[關鍵詞] 嗅覺; 嗅覺障礙; 評估方法; 動物實驗; 文獻綜述
[中圖分類號] R339.12 [文獻標識碼] A [文章編號] 1671-7562(2010)04-0434-04
doi:10.3969/j.issn.1671-7562.2010.04.041
嗅覺是人體原始的感覺功能之一,它同視覺、聽覺一樣,是人體捕獲外界信息的特殊裝置。嗅覺還可以通過中樞神經系統影響人的情緒、調節生命周期。嗅覺障礙患者對周圍的事物不感興趣,反應平淡,生活質量下降,更可以造成精神上的壓抑或憂郁。王鴻等[1]報道用T&T測試法測試了1 035例慢性鼻竇炎鼻息肉患者,86.3%的患者有嗅覺功能障礙,與患者的主訴有極顯著的差異,說明嗅覺功能改變沒有受到患者的注意。近幾年隨著人們對生活質量要求的提高,對嗅覺障礙的關注程度有了很大的提高。
嗅覺評估不僅僅是要判斷嗅覺功能是否正常,還需要進一步判斷嗅覺障礙的程度、性質、部位等因素,如果能提示病因以及預后則更有臨床、實驗應用的價值。在動物實驗中關于嗅覺功能的研究已經有了較長的歷史,出現了多種實驗方法,但是目前為止還沒有一個全面、客觀、高特異性的金標準方法出現,本文就目前動物實驗中的常見的嗅覺評估方法進行一個概括性的介紹。
1 行為學方法
動物實驗和臨床試驗的最大區別在于動物無法準確地和實驗者交流,所以行為學方法在動物實驗中就顯得極為重要。嗅敏動物的學習記憶能力、尋食能力等與嗅覺有很高的相關性,可以觀察、記錄其行為學的改變,從而判斷其嗅覺功能的變化。目前報道較多的可以評估嗅覺功能的行為學方法有以下幾種。
1.1 埋藏食物小球實驗(buried food pellet test,BFPT)
BFPT是目前最常用于檢測動物嗅覺功能的行為學檢測方法[2]。目前比較通用的方法由Nathan等[3]于2004年報道,他的實驗中使用找尋食物小球等待時間作為數據進行統計分析,即從小鼠被隨機放置于盒子中開始,到小鼠揭開食物小球并用它的前爪或牙齒抓住食物小球的時間,如果5 min(300 s)內小鼠未找到食物小球,即被移走。林靜等[4]以300 s(5次測試的平均值)內未找到食物小球作為判定小鼠存在嗅覺功能障礙的標準,并認為以300 s作為分組標準是合理的。
1.2 嗅覺測量儀
Slotnick等[5]利用行為學原理設計出一種用于動物實驗的嗅覺測量儀,可以通過改變氣味的濃度后觀察動物的行為學變化來評價其嗅覺。該系統經眾多實驗驗證其對動物嗅覺的檢測是有效的[6],因操作方便且可進行多種設計,此方法被廣泛應用于動物嗅覺功能的評估。
1.3 雙瓶實驗
有研究證實小鼠、大鼠在分辨某些物質的時候主要是依賴于嗅覺而非味覺,例如鹽酸、鹽酸奎寧(quinine HCl, QHCl)等有一定揮發性的物質 [7]。因嗅覺障礙時動物分辨飲用水和實驗溶液的能力下降,通過兩種溶液被動物飲用的程度可以評估動物嗅覺障礙的程度。
1.4 幼鼠超聲發聲實驗
新生小鼠嗅覺的產生比其他的感覺要早。新生小鼠嗅到成年鼠窩的氣味時可發出一種超聲作為回應,檢測這種超聲的出現與否可以判斷其嗅覺功能是否正常[8]。Lemasson等[8]用3-甲基吲哚來破壞新生小鼠的嗅上皮,結果成功地證實了該檢測方法的可行性。而且在該實驗中發現由于被破壞嗅覺的小鼠無法正確識別,其生存率大大降低,證明了嗅覺對新生小鼠有極其重要的作用。
行為學方法在動物實驗的嗅覺評估中有很重要的作用,歷史悠久、技術成熟,實驗方法較為簡單,實驗裝置花費較少,對嗅覺功能的初步評估價值較為肯定(尤其是埋藏食物小球實驗和Slotnick的嗅覺測量儀),可行性及可重復性較高。需要注意的是本類實驗受個體差異影響較大,實驗前應經預評估剔除先天差異比較大的個體,而且樣本量不宜過小,有時候還需對動物進行預先的訓練。為保證實驗的客觀性,需要很好地進行實驗設計與控制,有時連晝夜節律等變化的影響都需要考慮在內。行為學測試結果對嗅覺功能評估只是一個綜合的結果,對嗅覺障礙程度、部位等的判斷較差,如果能結合嗅覺誘發電位等客觀檢查可以做到更加客觀、可信。在過去的實驗中行為學測試往往與組織學檢查相結合,既增加了實驗的客觀性,又為進一步研究嗅覺產生機制或嗅覺障礙的原因提供了基礎。
2 客觀評估方法
嗅覺的感受、傳導是個比較復雜的過程,氣味分子通過鼻腔到達嗅黏膜后被其表面的黏液所吸附,進而在黏膜層中擴散,到達嗅細胞。達到閾濃度的氣味分子可刺激嗅細胞產生嗅覺電位,這是其感受過程。產生的嗅覺電位通過嗅神經穿過篩骨篩板,到達嗅球,其內有第2級神經元,再通過嗅束傳導至初級嗅皮質及皮質內側核,而后至海馬回的內嗅皮層即次級嗅皮層,神經沖動引起大腦皮層的激活才能最后引發嗅覺。嗅覺功能的客觀評估方法包括了對嗅覺感受、傳導通路上各種指標,例如影像學、電生理學、組織學等的測量。目前動物實驗中使用較多的及可能有較大發展前景的客觀評估方法包括以下幾類。
2.1 組織學方法
這里的組織學是泛指解剖取組織后進行的所有檢查,包括大體解剖學、病理學、免疫學、分子生物學等諸多學科的檢查方法。嗅覺系統的改變既可以由病變本身引起也可以是因為嗅覺障礙后的退行性變引起。組織檢查比結構影像檢查更有評估價值,因其可以更好地提示病因,也利于更好地研究嗅覺通路和嗅覺障礙產生的機制。目前組織學方法在動物實驗中有很廣泛的應用,從部位選擇上看整個嗅覺傳導通路包括從嗅黏膜直到海馬回的內嗅皮層都有報道,從實驗方法上看更是復雜多樣,最常用的幾種方法有如下幾種。
2.1.1 病理學檢查
這是早期免疫學技術及分子生物學技術還不是很發達時常用的檢查手段,在早期嗅覺研究中有較多的應用,在嗅覺障礙的動物標本上可以看到細胞凋亡、空泡等變化,雖然特異性較差,但是也能提供宏觀的信息,現在常常和其他檢查方法一起使用,例如在陳志宏等的實驗中在進行其他檢查之前使用了HE染色方法檢查了模型小鼠的嗅上皮,發現其嗅上皮變薄,其中的感覺神經元的細胞核層數變少[9]。
2.1.2 蛋白及核酸表達的檢查
對相應組織中某些標志性蛋白及核酸的檢查可以間接地反映嗅覺功能及提示嗅覺障礙的原因。例如用免疫組化方法檢查嗅覺通路中嗅標記蛋白(olfactory marker protein, OMP)、酪氨酸羥(tyrosine hybroxylas, TH)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)、c-Fos蛋白等標記物在許多文獻中都有記載。Buron等[10]在丙酮吸入誘導的嗅覺障礙實驗中使用了嗅上皮組織的OMP及增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作為觀察指標,發現丙酮對于嗅上皮的損傷是有選擇性的。有學者使用多巴胺及細小白蛋白作為標記物進行免疫組化檢查,發現失嗅動物模型的嗅球中含多巴胺及細小白蛋白的神經元細胞數量明顯減少,認為通過該失嗅動物模型可以對嗅球萎縮進行定量描述,提示多巴胺及細小白蛋白在嗅球中的表達對于失嗅的作用[11]。c-Fos蛋白可反映大腦組織活動程度,對c-Fos蛋白的觀察可以一定程度上起到功能磁共振的作用[12]。
2.2 電生理學方法
2.2.1 嗅電圖
將電極直接置于嗅區黏膜,當其接受嗅素刺激時記錄到的一種慢相負性電位變化稱為嗅電圖,目前普遍認為它是單個嗅細胞電位變化的總和,嗅電圖已經在動物實驗中得到證實[13]。嗅電圖最大的缺陷在于雖然其對嗅黏膜損傷引起的嗅覺障礙有較大的意義,但是對于黏膜后傳導通路以及嗅球、海馬回等中樞病變導致的嗅覺障礙沒有什么評估價值。
2.2.2 嗅覺腦電圖
嗅覺誘發腦電圖是指在給予嗅刺激時,實驗對象的腦電圖可發生變化,Hirano等[14]用狗做實驗時成功地獲得了該變化,在他的實驗中發現腦電圖的快波對嗅覺功能的意義較大。嗅覺誘發腦電圖又相繼在大鼠等其他動物身上得到了驗證[15]。嗅覺腦電圖產生的機制還不是很明確,而且其特異性不是很高,故目前在動物實驗中研究、應用的較少。
2.2.3 嗅覺誘發電位
又稱為嗅覺事件相關電位(olfactory event-related potentials,OERP),最早是用電刺激動物嗅黏膜時在頭皮特定部位記錄到穩定的腦電位的變化,該方法經過一段時間的發展后認為其和自然嗅覺之間有一定的差距,故逐漸被化學氣味誘導的嗅覺誘發電位所取代,目前使用的已經比較少。早期化學氣味刺激除了有嗅覺刺激外還常常伴有物理刺激及對三叉神經的化學刺激,這些非嗅刺激干擾了正常嗅覺誘發電位的獲得。隨著僅能興奮嗅覺系統而不興奮三叉神經系統的化學物質如香草醛等,以及Kobal式嗅覺刺激器的出現,嗅覺誘發電位研究成為嗅覺研究領域的熱點。嗅覺誘發電位儀至少包括嗅覺刺激器及腦電采集系統,測量時需要在電聲屏蔽室進行,且需要給予一定的白噪聲掩蔽刺激探頭釋放刺激時產生的干擾噪聲。目前動物嗅覺誘發電位各波的具體來源以及與疾病間的相互關系還不清楚,嗅覺誘發電位的出現是否意味著動物確實產生了嗅覺還不能肯定,所以用來證明嗅覺傳導通路是否暢通比較可行[16],而暫不能用于嗅性疾病的定位、定性診斷。嗅覺誘發電位應該是最可能成為動物嗅覺評估客觀標準的檢查方法。
3 影像學方法
3.1 嗅覺系統結構影像檢查
有研究證明嗅球及嗅束等神經結構的生長與周圍神經沖動的輸入有關[17],所以嗅覺障礙后嗅覺系統各部位可有一定的不依賴于年齡的結構改變,通過磁共振影像檢查可以發現這些改變,例如嗅球體積變小、嗅溝缺失或變淺、嗅束缺失等現象,從而間接評價嗅覺功能。
3.2 嗅覺系統功能影像檢查
這是目前嗅覺研究的熱點方向之一,主要技術有功能性磁共振成像(fMRI)、PET成像和腦信號的光學成像等。
3.2.1 功能磁共振檢查
功能磁共振檢查技術有很多,用于嗅覺系統功能的fMRI技術主要是(blood level dependent fMRI, BOLD fMRI),當氧合血紅蛋白的比例增加時或去氧血紅蛋白含量減少時,T2信號縮短效應減弱,表現為MR信號增強。嗅覺功能成像既能反映血流的變化,也能反映神經元活動的代謝變化,近些年在研究神經功能方面發揮著巨大的作用,特別是fMRI無放射暴露,可反復測試,且時間、空間分辨率要優于PET成像,故是目前嗅覺功能成像的主要方法。在大鼠實驗中已經證實,7 T的fMRI能夠顯示氣味刺激后大鼠嗅球的活化[11]。其空間分辨率很高,對于研究嗅覺相關皮層的定位、嗅覺功能障礙情況下嗅覺相關皮層反應的變化等有極大的應用價值。有學者擬通過信息技術將嚙齒類動物嗅球的激活圖像編成二維的氣味圖(OdorMap,OM)及氣味圖數據庫(OdorMap Database,OMDB)以利于嗅覺工作者對嗅覺系統的研究[18]。功能磁共振應用在動物實驗的嗅覺評估中需要注意的是:首先動物是不能配合磁共振檢查的,故需要在麻醉下進行;其次磁共振是強磁場環境,故嗅覺刺激裝置不能由金屬制成。
3.2.2 腦功能光學成像
腦功能光學成像是近年來神經外科的熱點研究方向,目前主要的實驗技術有激光散斑襯比成像和內源信號光學成像。而應用于嗅覺功能檢查的主要是內源信號光學成像,這里所指的內源信號,并不是神經元所表現出來的電信號,而是指由神經元活動所引起的有關物質組分、運動狀態的改變而導致其光學特性的變化,在與某些特定波長的光量子相互作用后,得到的包含了這些特性的光信號,包括:血紅蛋白信號、氧合血紅蛋白信號、光散射特征信號等[19-20]。許多生理性過程如血紅蛋白氧合度、細胞色素的氧合狀態、神經膠質和神經元腫脹、功能性血流量改變等變化,都會影響到組織光反射特性的改變。通過探測反射光的變化量,就可以獲得這種特異性的內源光學信號。內源光學信號成像在動物實驗中已用于多種腦功能皮層功能的檢查,比如視覺(貓、小鼠等)、軀體感覺皮層(大鼠、貓、松鼠猴等)、聽覺皮層(南美栗鼠、貓、雪貂等)。Bathellier等[21]在實驗中使用了內源光學信號原理和突觸素熒光標記兩種方法分別獲得了香芹酮、苯甲酸甲酯刺激后大鼠嗅球的激活情況,在內源光學信號成像下,激活的嗅小球反光率下降,呈相對的冷色調,而在熒光標記實驗中激活區域熒光反應較強。雖然內源光學信號成像的時空分辨率都較高,但是其穿透腦皮層的能力受限(大約數百微米),所以對于深層腦組織的觀察就沒有什么效果了。由于內源光學信號的確切生理來源至今沒有定論,所以為了闡述內源光信號對應的生理意義及其與神經元電活動的關系,還需要與其他方法進行對比研究。
從其他感覺的評估方法來看,功能磁共振和誘發電位是研究的發展方向,但目前嗅覺產生、傳導機制尚未完全明了,相關檢查技術尚處于起步階段,還需要進行大量的研究。目前的嗅覺研究可以根據不同的實驗要求及實驗條件選擇不同的實驗方法及實驗方法的組合。嗅覺誘發電位及功能磁共振檢查由于其初期投入較大,對硬件及技術條件要求較高,開展難度較大,在國內只有少數醫院在從事這方面的實驗。行為學方法操作簡單,技術成熟,效果肯定,有很強的實用價值。組織學方法對于機理的研究十分重要,并且隨著對嗅覺認知的加深,越來越多的標記物被發現,評估方法也越來越豐富。如果可以出現一種簡單易行的嗅覺評估方法,那么可以極大地促進嗅覺的研究。
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動物行為學方法范文第5篇
1鳥類腦大小對覓食創新的影響
很多動物行為學家都認為，在動物前腦大小與覓食創新之間存在著神經生物學聯系［3］，因為前腦與動物行為的可塑性密切相關。通常是前腦越大，覓食創新能力越強。根據這一基本原理，Lefebvre等人（2004）［4］研究了北美洲和大不列顛群島上各種鳥的前腦大小與覓食創新之間的關系。所謂覓食創新是指能取食和利用新的食物種類或采用新的覓食技巧。為此，研究人員利用了9種鳥類學雜志所提供的資料，收集了322種覓食創新（或覓食新技能），其中126種覓食新技能屬于大不列顛群島上的鳥類，192種屬于北美洲的鳥類（表1）。這些覓食創新包括銀鷗捕到小嚙齒動物后將它們扔到巖石上摔死或沉入水中淹死；也包括普通烏鴉利用過路的小汽車把堅果壓碎，這相當于把小汽車當鉗子使用［5］Lefebvre等人曾計算過這些創新行為在不同類群（目鳥類中的分布情況，同時還分析過不同類群鳥類在大不列顛和北美洲的常見程度或稀有程度。在掌握各種鳥類覓食創新行為的同時，研究人員還獲得了這些鳥類前腦相對大小的資料［6］。無論是在大不列顛群島還是北美洲，鳥類前腦的大小都與覓食創新密切相關。凡是前腦比較大的鳥類，其覓食創新行為也更為常見。雖然有很多覓食創新都是在一次觀察中發現的，但對多達322例覓食創新行為的大規模分析中，發現在前腦大小與覓食創新之間確實存在著直接的關系，這表明，這是動物行為學中一個重要而有意義的研究新領域。Sol等人（2006，2007）［7－8］曾研究過鳥類腦子較大是否對其生存和生殖有利的問題。長期以來人們一直未經驗證地認為，腦相對較大有助于提高動物的適合度（fitness），特別是當種群進入一個新的陌生環境的時候，這時覓食創新對動物的生存和生殖就特別重要［9－10］。Sol等人曾研究了646例物種被引入新環境的實驗（涉及196種鳥），其中大多是研究人員將一種鳥引入一個島嶼或原分布區以外的地方［11－12］。研究人員還收集了196種鳥有關腦大小的資料，并根據鳥大腦就大，鳥小腦就小的基本事實作了相應的校正，最終發現，在鳥的腦大小和能在新環境中成功定居之間存在著正相關關系，這是因為腦子較大的鳥類具有更強的覓食創新能力，這種能力可大大提高鳥類的食物攝取率，從而能提高鳥類的生存機會和生殖機會。
2動物有計劃未來的能力嗎？
學習是動物借助于個體生活經歷和經驗使自身行為發生適應性變化的過程，從這一學習的定義可以看出，任何當前發生的行為都是與此前的生活經歷和經驗相關聯的。如果動物也能像我們人類那樣能夠根據先前的經歷和經驗預測和計劃未來的話，那一定會大大增加自身的存活機會和適合度。目前屬于這方面的研究還很少，因為長期以來人們一直認為計劃未來是人類獨有的能力，這也是人類與所有其他動物存在的一個主要差異［13］。然而隨著時間的推移已變得越來越清楚的是，動物也具有一些一度被認為是人類所獨有的行為，例如使用工具和純粹是有利于未來生存的行為，這促使動物行為學家開始對動物有沒有計劃未來的能力產生興趣并進行研究。動物行為學家認為，要想確認計劃未來的行為必須滿足兩個條件：首先該行為必須是創新的或新穎的，它不是某些本能行為的表現，例如：遷飛行為有很多本能成分，雖然顯示有一定的“計劃性”，但不是我們要求的那樣；其次，計劃未來的行為不一定與動物當前的動機狀態相關，而必定會涉及到未來某一時刻的動機狀態。下面介紹一個最新的關于動物計劃未來的研究實例，這就是松鴉為了計劃未來而改變其覓食行為的現象［14］。松鴉是進行這類研究的一個極好的物種，因為它具有令人難以置信的記憶力，它生活在高海拔地區，常常要為未來貯藏大量的食物，每個個體每年大約要貯藏3萬多粒種子，冬季和春季幾乎完全依賴秋季貯藏的種子為生。松鴉不僅能記住它們貯藏食物的地點，而且還十分注意當它們在貯藏食物時誰在觀察它們。在這種情況下，它們此后會把食物重新挖出來并進行深埋，以防這些食物被偷食［15］。Raby等人（2007）［16］利用一個簡單而巧妙的實驗檢驗了松鴉是否具有計劃未來的能力。研究人員為松鴉提供兩個隔室，其中一個隔室中含有食物松子，另一個隔室中沒有食物，每天早晨松鴉只能見到和進入一個隔室，在連續6天的實驗期間，兩個隔室是交替出現的，各出現3次。每天實驗的前一天晚上，不為松鴉提供任何食物，因此它們在見到隔室期間是處于饑餓狀態。6天實驗結束后，每天天黑前兩小時，只為松鴉提供一點點食物，使它們得不到可供貯藏的種子。此后再為它們提供一個備有大量松子的場所，并提供兩個以前曾多次拜訪過的隔室，但現在每個隔室內又安裝了一個能貯藏食物的“貯食杯”，使鳥類在天黑前可以把食物貯藏起來，如果它們愿意這樣做的話。實驗結果發現，在兩個隔室中它們總是在其中的一個隔室中貯藏更多的食物（松子），而這個隔室是它們以前拜訪過的那個不含有食物的隔室，這說明在越是缺乏食物的環境中，它們貯藏食物的行為就表現得越明顯，這對于保障未來的生存是很重要的，這實際上是“為未來著想的一種行為適應性”。接下來Raby等人又安排了一個更加有趣的實驗，他們訓練松鴉使其知道在一個隔室中可以吃到花生，而在另一個隔室中可以吃到谷粒，松鴉對這兩種食物都很愛吃。當按照上述同樣的方法進行實驗時，發現松鴉在含有花生的隔室中貯藏的食物是谷粒，而在含有谷粒的隔室中貯藏的是花生，這表明松鴉很注意并喜歡使它們的食物多樣化，在它們為未來準備食物時也是遵循這一使食譜多樣化的原則。除鴉科鳥類（如松鴉和星鴉）外，其他動物是否也有“為未來著想”和計劃未來的行為，目前還研究得很少，尚有待于擴展研究范圍。
3腦海馬大小與貯食行為的關系
為了了解鳥類覓食行為與空間記憶力的問題，Hea－ley和Krebs（1992）［17］曾研究了7種鴉科鳥類的腦海馬大小與貯藏食物的能力之間的關系。他們之所以選擇研究腦海馬是因為已知鳥類大腦的這個區域與食物的回收（復得）有密切關系。同時，鴉科鳥類也是研究這一問題的最好對象，因為在鴉科鳥類的各個物種之間，貯食行為的表現各不相同，便于用比較研究法進行分析。有些鴉科鳥類根本就不貯藏食物，而另一些鴉科鳥類則 必須在長達9個月期間完全依賴貯藏的食物為生［18－19］。Healey和Krebs［17］研究了兩種幾乎不貯藏食物的鴉科鳥類，即寒鴉（Corrus monedula）和紅嘴山鴉（Pyr－rhocorax graculus），還研究了4種貯藏食物的鴉科鳥類，它們是禿鼻烏鴉（Corvus frugilegus）、歐洲烏鴉（Corviscorone）、喜鵲（Pica pica）和紅嘴藍鵲（Cisia erythro－rhyncha），此外還研究了1種不僅貯藏食物，而且在長達9個月期間必須記住6 000～11 000粒種子埋藏地點的鴉科鳥類，即歐洲松鴉（Garrulus grandarius）。當檢查貯食行為與腦海馬大小之間關系的時候，發現這些鳥類都表現出明顯的正相關關系，即海馬體積越大，貯藏食物的行為就越發達，這表明：海馬大小是鴉科鳥類空間記憶力和貯食行為進化的關鍵因素。此外，動物行為學家還研究了在一個物種內部個體之間海馬大小與貯食能力之間的關系，例如：生活在食物短缺環境中的個體比生活在食物豐富環境中的個體具有更發達的貯食能力，腦海馬的體積也比較大［20］。這就是說，當鳥類生活在嚴酷環境中的時候，自然選擇有利于增強它貯存食物的能力和此后重新找回這些食物的能力，也有利于海馬體積的增大和海馬神經元數量的增加。Pravosudo及其同事用來自食物豐富的科羅拉多州和來自食物短缺的阿拉斯加州的兩個黑冠山雀（Po－ecile atricapilla）種群檢驗和證實了這一觀點。他們從阿拉斯加州的安克雷奇（Anchorage）捕捉15只活鳥，從科羅拉多州的溫澤（Windsor）捕捉20只活鳥，然后將它們帶回加利福尼亞大學的實驗室，45天后測定這些鳥類貯藏種子之后再重新找到這些種子的能力。當為這些鳥提供可供貯藏的種子時，發現來自阿拉斯加（食物短缺）的山雀比來自科羅拉多（食物豐富）的山雀要貯藏更多的種子。同樣重要的是，阿拉斯加山雀不僅比科羅拉多山雀貯藏更多的種子，而且它們重新找回這些種子的效率也更高，所犯錯誤也最少。從海馬大小的角度進行比較，雖然阿拉斯加山雀比科羅拉多山雀的個體小體重輕，但其海馬的體積卻比后者大，而且海馬所含有的神經元數量也更多。有趣的是，在不給予兩地山雀貯藏食物的機會的情況下，它們之間海馬大小的差異仍然存在，這表明：貯藏行為本身并不會使阿拉斯加山雀的海馬變大，相反，兩地山雀之間的差異應當是自然選擇作用于海馬大小的結果。目前，有關這一領域的大量工作正在進行之中。
