靈芝孢子油減毒作用
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摘要：目的觀察靈芝孢子油的扶正減毒作用。方法以正常和H22荷瘤小鼠為對象，通過檢測外周血WBC數(shù)、骨髓有核細胞數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)來觀察口服靈芝孢子油(2.5，1.25，0.625g/kg)對于環(huán)磷酰胺（Cy）化療及60Co放療的減毒作用；通過小鼠碳廓清實驗、血清溶血素測定實驗檢測藥物對H22荷瘤小鼠免疫功能的影響。結果靈芝孢子油中高劑量組均可明顯對抗由大劑量Cy、60Co照射造成的正常及荷瘤小鼠外周血WBC,骨髓有核細胞數(shù)，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)下降(P＜0.01,P＜0.05)。靈芝孢子油各劑量均可顯著提高荷瘤小鼠吞噬系數(shù)α，中高劑量組可明顯提高荷瘤小鼠的血清半數(shù)溶血值（P＜0.01,P＜0.05)。結論靈芝孢子油可減低Cy和60Co所致的骨髓抑制毒性，并可顯著提高小鼠細胞和體液免疫功能。
關鍵詞：靈芝孢子油；免疫；環(huán)磷酰胺
靈芝是祖國醫(yī)藥寶庫中的珍貴藥品，我國最早的藥學專著《神農本草經》將其列為“上品”。基于靈芝的確切臨床治療作用，近年來對其化學成分及作用機理進行了大量的研究，對靈芝的生殖細胞――孢子的藥用價值研究也日趨深入。以往的研究表明，靈芝孢子具有顯著的防癌、抗腫瘤作用，其功效是靈芝子實體的60～70倍。本實驗所用靈芝孢子油是利用超臨界CO2流體萃取技術從靈芝破壁孢子中提取出來并濃縮富集而得，其各種有效成分（如三萜類）的含量均較傳統(tǒng)提取方法顯著提高。本實驗主要研究其對荷瘤小鼠的免疫調節(jié)及對常規(guī)放化療的減毒作用，以期為靈芝孢子油的臨床抗腫瘤輔助應用提供實驗依據(jù)。
1材料
1.1藥物靈芝孢子油，由廣州靈芝孢子油現(xiàn)代中藥研究開發(fā)有限公司提供，批號：050601，臨用前用豆油稀釋成所用濃度。云芝孢內糖肽膠囊，南京老山藥業(yè)股份有限公司，批號：050104，規(guī)格：0.5g×21粒，臨用前用生理鹽水成所用濃度。注射用環(huán)磷酰胺，上海華聯(lián)制藥有限公司，規(guī)格：200mg/瓶，批號：020804。
1.2瘤株與動物H22小鼠肝癌細胞，由中科院上海藥物研究所提供。ICR小鼠，雌雄各半，18~22g，由中國藥科大學動物室提供,合格證號：蘇動質SCXK（蘇）2002-0011。
2方法
2.1靈芝孢子油對正常、H22荷瘤小鼠化療(Cy)的減毒作用取ICR小鼠60只，按移植性腫瘤研究法［1］接種H22實體瘤，24h后隨機分組，實驗設：空白對照組，豆油對照組(20ml/kg)，靈芝孢子油高、中、低劑量組(2.5，1.25，0.625g/kg)ig給藥，云芝胞內糖肽膠囊組(1g/kg)ig給藥。另取ICR小鼠60只，不接種荷瘤，分組給藥方法同上。各組給藥1次/d，共7次，各組于給藥第4，5天（除空白組外），連續(xù)2dipCy(100mg/kg)，于停藥后24h，各組眼眶靜脈取血，鏡檢外周血白細胞總數(shù)，同時摘取一側完整股骨、胸腺、脾臟，分別測定骨髓有核細胞數(shù)，稱胸腺、脾重，計算胸腺、脾臟系數(shù)，并進行統(tǒng)計學處理(t檢驗)。
2.2靈芝孢子油對正常小鼠、H22荷瘤小鼠60Co放療的減毒作用取ICR小鼠60只，按移植性腫瘤研究法［1］接種H22實體瘤，24h后除空白對照組10只動物外，其余50只小鼠進行60Co照射，劑量為500rad；60Co照射后動物隨機分為5組，實驗設：空白對照組，豆油對照組(20ml/kg)，靈芝孢子油高、中、低劑量組(2.5，1.25，0.625g/kg)ig給藥，云芝胞內糖肽膠囊組(1g/kg)ig給藥。另取ICR小鼠60只，不接種荷瘤，除空白對照組10只動物外，其余50只小鼠進行60Co照射，劑量為500rad；60Co照射后動物隨機分為5組，分組及給藥方法同上。各組均給藥1次/d，共7次，于停藥后24h，各組眼眶靜脈取血，鏡檢外周血白細胞總數(shù)，同時摘取一側完整股骨、胸腺、脾臟，分別測定骨髓有核細胞數(shù)，稱胸腺、脾重，計算胸腺、脾臟系數(shù)，并進行統(tǒng)計學處理(t檢驗)。2.3靈芝孢子油對H22荷瘤小鼠網狀內皮系統(tǒng)吞噬功能的影響取ICR小鼠50只，按移植性腫瘤研究法［1］接種H22實體型瘤。次日隨機分為5組，實驗設：豆油對照組(20ml/kg)，靈芝孢子油高、中、低劑量組(2.5，1.25，0.625g/kg)ig給藥，云芝胞內糖肽膠囊組(1g/kg)ig給藥。共給藥11次。于末次給藥后24h，尾靜脈注射印度墨水，注入后1min及5min從小鼠眼眶后靜脈叢取血，立刻吹入Na2CO3液中，于680nm處比色，按下式計算廓清指數(shù)K及吞噬系數(shù)α值。所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理(t檢驗)
廓清指數(shù)K=(logOD1-logOD5)/(t5-t1)
吞噬系數(shù)α=(體重/肝脾合重)×(K)1/3
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2.4靈芝孢子油對H22荷瘤小鼠體液免疫功能的影響取ICR小鼠50只。按移植性腫瘤研究法［1］接種H22實體型瘤。次日隨機分為5組，實驗設：豆油對照組(20ml/kg)ig給藥，靈芝孢子油高、中、低劑量組(2.5,1.25,0.625g/kg)ig給藥，云芝胞內糖肽膠囊組(1g/kg)ig給藥。共給藥11d，于第7天，各組小鼠腹腔注入綿羊紅細胞0.2ml/只(20%)進行初次免疫，末次給藥1h后，取血，分離血清，測定并計算半數(shù)溶血值HC50，進行組間t檢驗，比較差異的顯著性。
3結果
3.1靈芝孢子油對正常小鼠、H22荷瘤小鼠化療(Cy)的減毒作用結果如表1~2所示，與空白組相比，Cy可顯著抑制正常小鼠和荷瘤小鼠外周血WBC、骨髓有核細胞數(shù)、胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)（P＜0.01）。與Cy模型組相比，靈芝孢子油中高劑量組及云芝胞內糖肽組均可對抗H22荷瘤和正常小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、WBC數(shù)和骨髓有核細胞數(shù)的下降(P＜0.05或P＜0.01)。
表1靈芝孢子油對正常小鼠化療的減毒作用(略)
與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與豆油+Cy組比較,*P＜0.05，**P＜0.01，n=10
表2靈芝孢子油對H22荷瘤小鼠化療的減毒作用(略)
與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與豆油+Cy組比較，*P＜0.05，**P＜0.01
3.2靈芝孢子油對正常小鼠、H22荷瘤小鼠60Co放療的減毒作用結果如表3、4所示，與空白組相比，60Co可顯著降低正常小鼠和荷瘤小鼠外周血WBC、骨髓有核細胞數(shù)、胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)（P＜0.01）。與60Co模型組相比，靈芝孢子油中高劑量組及云芝胞內糖肽組均可明顯抑制正常及荷瘤小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)、WBC數(shù)和骨髓有核細胞數(shù)的下降（P＜0.01，P＜0.05）。
表3靈芝孢子油對正常小鼠60Co放療的減毒作用(略)
與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與豆油+60Co組比較,*P＜0.05，**P＜0.01，n=10
表4靈芝孢子油對H22荷瘤小鼠60Co放療的減毒作用(略)
與空白組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與豆油+60Co組比較,*P＜0.05，**P＜0.01，n=10
3.3靈芝孢子油對H22荷瘤小鼠網狀內皮細胞吞噬功能的影響結果如表5所示。與豆油對照組相比，靈芝孢子油各劑量組及云芝胞內糖肽組均可顯著提高H22荷瘤小鼠的廓清指數(shù)K及吞噬系數(shù)α值(P＜0.01或P＜0.05)。表明靈芝孢子油可顯著提高小鼠網狀內皮細胞的吞噬功能。
3.4靈芝孢子油對H22荷瘤小鼠體液免疫功能的影響結果如表6所示，與豆油對照組相比，靈芝孢子油中高劑量組及云芝胞內糖肽組可顯著提高H22荷瘤小鼠血清半數(shù)溶血值(HC50)(P＜0.01或P＜0.05)。表明靈芝孢子油可顯著提高H22荷瘤小鼠的體液免疫功能。
表5靈芝孢子油對H22荷瘤小鼠網狀內皮細胞吞噬功能的影響(略)
*P＜0.05，**P＜0.01與豆油對照組比較.n=10
4討論
當前對惡性腫瘤的治療是采用多種治療手段聯(lián)合應用的綜合治療模式,而放療、化療作為綜合治療中的重要手段，對腫瘤細胞缺乏特異性選擇,在殺傷癌細胞的同時也損傷了正常細胞,致使機體免疫功能下降,骨髓造血功能明顯受到抑制,引起外周WBC下降,從而影響治療效果。腫瘤患者的免疫功能不僅與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，而且對判斷腫瘤患者轉歸和預后都有重要的參考價值［2，3］。腫瘤的存在會抑制機體的細胞免疫及體液免疫功能，而放化療治療又會進一步加重機體的免疫抑制［4］。因此在抗腫瘤治療中，提高機體的免疫力、降低放化療的毒性，成為抗腫瘤治療的一個主要方面。近年來，中藥因其良好的免疫調節(jié)、減毒抗癌作用越來越引起人們的重視，從中藥中尋找抗腫瘤輔助治療的生物反應調節(jié)劑已成為當今研究的熱點［4，5］。靈芝是一味在中醫(yī)中沿用2000多年的中藥，是祖國中醫(yī)藥寶庫中的珍品，素有“仙草”之譽。古今藥理與臨床研究均證明，靈芝確有防病治病、扶正固本、延年益壽之功效，廣泛用于許多慢性病的治療，如癌癥、肝炎、II型糖尿病、高血壓等［7］。近年來，對靈芝屬真菌的化學成分及臨床作用的研究頗多，對靈芝的生殖細胞--孢子的藥用價值研究也日益加強。現(xiàn)有的研究證明，靈芝孢子具有顯著的防癌、抗腫瘤作用，其功效是靈芝子實體的60～70倍。靈芝孢子的功效成分主要有三萜類、多糖類、有機鍺等［8］。靈芝孢子油是靈芝孢子的脂溶性物質，包括全部三萜類、核苷及有機鍺，與部分水溶性物質（多糖類），經濃縮后的集合，具有極佳的抗腫瘤生物活性。本實驗所用的靈芝孢子油是利用破壁靈芝孢子粉由超臨界CO2流體萃取合超聲強化提取，經進一步濃縮富集而得，其三萜類活性成分的含量高于傳統(tǒng)的提取方法。前期體內外實驗均已證實，此種方法提取的靈芝孢子油對多種腫瘤均有明顯的抑制作用。本實驗研究表明，靈芝孢子油中高劑量組可顯著提高H22荷瘤小鼠的免疫吞噬系數(shù)α及和血清半數(shù)溶血值，說明其對小鼠網狀內皮系統(tǒng)（RES）吞噬功能及其體液免疫功能均有明顯的提高作用。靈芝孢子油對Cy和60Co照射造成的正常或H22荷瘤小鼠外周血WBC、骨髓有核細胞數(shù)的減少、免疫器官萎縮等毒性反應,雖然不能使其完全恢復到正常水平,但均有明顯保護作用。由此證明靈芝孢子油具有抗癌、扶正、減低放化療毒性之功效，提示其在臨床抗腫瘤治療中可起到扶正減毒、改善患者生活質量的作用，有良好的應用前景和研究價值。對于靈芝孢子油提高免疫及對Cy和60Co照射減毒作用的內在機理，還有待于進一步研究。
