淺談蛋白克隆的功能鑒定方法

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一、CsupOBP1與不同氣味化合物的結合能力

熒光探針1-NPN和CsupOBP1的結合曲線。熒光強度隨加入1-NPN濃度的提高而增強，求得兩者間的結合常數(shù)為10．93μmol/L。以1-NPN為探針，利用熒光競爭結合實驗測定了38種不同化合物與CsupOBP1的結合能力(圖5:B～H)。結果顯示，在被測化合物中，只有β-紫羅蘭酮與CsupOBP1的結合能力最強，結合常數(shù)達9．53μmol/L，其他化合物的結合能力均較差。其中，在測定CsupOBP1與烷烴類和脂肪酸類化合物的結合能力時，隨配體濃度的提高熒光強度反而上升，表明CsupOBP1與脂肪酸無結合能力。

二、二化螟成蟲對不同植物氣味的觸角電位反應

根據(jù)體外配體結合能力的測定結果，選取β-紫羅蘭酮等4種與CsupOBP1具有較強結合能力的植物氣味進行了觸角電位反應測定。結果表明，雌雄成蟲對被測氣味［雄蟲對(+)-雪松醇除外］均可產生顯著的EAG反應。4種氣味相比較，雄蟲對β-紫羅蘭酮產生的反應顯著強于其他3種化合物，但在雌蟲中4種氣味間沒有顯著差異。另外，雄蟲對β-紫羅蘭酮的EAG反應明顯強于雌蟲的反應(5．86mV)，兩者相差近1倍。

三、討論

本研究從二化螟克隆了一個非典型的OBP基因CsupOBP1，同時也是在二化螟中發(fā)現(xiàn)的第一個Minus-COBP，說明了二化螟中OBP種類的多樣性。系統(tǒng)進化分析表明，CsupOBP1和另外8個Minus-COBP形成一個獨立的分支，它們分別來源于家蠶(5個)、棉鈴蟲(2個)和煙芽夜蛾(1個)。前人對不同昆蟲基因組序列所含OBP的比較發(fā)現(xiàn)，Minus-COBP更多存在于較原始的昆蟲中，而Plus-COBP則更多存在于進化的物種中，因此推測ClassicOBP(典型OBP)和Plus-COBP起源于。鑒于半胱氨酸(Cystein)位點間可以形成二硫鍵，且二硫鍵在高級結構及其穩(wěn)定上起重要作用，OBP向著產生更多二硫鍵的方向進化，可能使OBP的結構更為復雜，以適應對特殊氣味物質的嗅覺需求。組織表達譜分析及雌雄差異比較是了解基因功能的基本途經。利用RT-qPCR技術的測定結果表明，CsupOBP1在二化螟幼蟲期的表達量遠高于成蟲期，表明該基因在幼蟲期可能起到更為重要的作用;而在幼蟲頭部的表達量是其他部位的2倍以上，鑒于頭部作為嗅覺和味覺的中心，暗示該基因在幼蟲的嗅覺和味覺中起作用。類似地，家蠶OBP23基因在成蟲期的表達量也明顯低于幼蟲期。在成蟲期，CsupOBP1在足和翅的表達量最高。除觸角外，很多昆蟲的足和翅上也分布有一些味覺及嗅覺感器，行使特定的化感功能，如一些鱗翅目昆蟲的前足跗節(jié)上著生有化感器，用于感受同種雌蟲產卵時隨卵一起分泌到葉片上的抑卵信息素，從而調節(jié)同種雌蟲在不同的葉片(或部位)產卵，避免后代對食物的過度競爭。CsupOBP1在足和翅中的顯著高表達，其功能值得進一步研究。此外，CsupOBP1在雄蟲觸角中也具有較高的表達，但雌蟲觸角的表達量卻很低，這意味著CsupOBP1在雄蛾的嗅覺中可能起到更為重要的作用。為了進一步探討CsupOBP1的嗅覺功能，我們利用原核表達系統(tǒng)和親和層析法對其進行了大量表達和純化，然后體外測定了CsupOBP1與包括常見植物氣味在內的38種化合物的結合能力。在結合試驗中，一般認為結合常數(shù)(Ki值)在10μmol/L以下時說明配體和蛋白有較好的結合能力。而本研究所測配體中，只有β-紫羅蘭酮與CsupOBP1的結合能力低于這個標準。前人對棉鈴蟲2個的研究也發(fā)現(xiàn)，2個OBP在被測的85種化合物中均以與β-紫羅蘭酮的結合能力最強，結合常數(shù)分別為。

四、結論

β-紫羅蘭酮作為一種香味組分，廣泛存在于包括水稻在內的很多植物的花和其他組織中，而昆蟲常常利用一些香味物質對寄主植物進行定位綜合組織表達譜及配體結合實驗結果，我們推測CsupOBP1可能通過對植物氣味(特別是β-紫羅蘭酮)的感受，從而在二化螟幼蟲及成蟲對寄主植物或組織的嗅覺定向中起作用。本文以成蟲觸角進行的觸角電位測定結果也與該推測一致，無論雌蟲還是雄蟲對β-紫羅蘭酮等幾種氣味物質均可產生顯著的觸角電位反應，而且雄蟲對β-紫羅蘭酮的EAG反應顯著強于其他3種氣味物質;此外，雄蟲對β-紫羅蘭酮的EAG反應2倍于雌蟲的反應，這與CsupOBP1在雄蟲觸角內的表達量顯著高于雌蟲觸角的結果也是一致的，進一步說明CsupOBP1在雄蛾的嗅覺中可能起到更為重要的作用。最后要指出的是，本文通過組織表達特性、體外配體結合試驗及觸角電生理測定，均間接說明CsupOBP1在二化螟對寄主植物氣味(特別是β-紫羅蘭酮)的嗅覺中起作用，但確定性的結論有待利用基因沉默等技術進一步研究。

作者：賈洪芳單位：北京科技大學