淺談無漿體的克隆及表達實驗

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1材料與方法

1.1實驗動物

普通級新西蘭白兔，3～4月齡，體重2.5～3.0kg，購自哈藥集團制藥總廠動物實驗中心，動物合格證號：SCXK（黑）2011-005；商品蛋雞購自黑龍江省大慶市禽蛋公司養雞場。

1.2菌株及質粒

主要試劑T4DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、PfxplatinumDNA聚合酶、DNAmarker、AgaroseGelDNAExtractionKit、質?？焖偬崛≡噭┖屑暗拖鄬Ψ肿淤|量蛋白質marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；X-gal和IPTG購自武漢華美生物工程有限公司；EcoRⅠ、SalⅠ、牛血清蛋白、Giemsa染色液、酵母提取物和胰蛋白胨購自上海生工生物工程技術服務有限公司；細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；兔抗MSP1α和MSP1β多克隆抗體由本院預防獸醫學實驗室自制；HRP標記的山羊抗兔IgG購自，INC公司；FITC標記的兔抗雞IgG購自上海華壹生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。1.5MSP1α和MSP1β基因的擴增按細菌基因組提取試劑盒說明書提取基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，PCR擴增MSP1α和MSP1β基因。MSP1α基因反應條件為：94℃預變性5min；94℃1min，55℃1min，68℃1min，共30個循環；68℃延伸7min。MSP1β基因反應條件除將退火溫度升高至63℃，其他同上。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2重組表達

將鑒定正確的陽性質粒和pGEX-6p-1分別經EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，回收目的基因片段及載體片段，經T4DNA連接酶14℃連接2h，轉化感受態E.coliBL21（DE3），挑取陽性克隆，提取質粒，經PCR及雙酶切鑒定。鑒定正確的質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序正確的重組表達質粒分別命名為pGEX-6p-1-MSP1α和pGEX-6p-1-MSP1β。目的基因的誘導表達將測序正確的重組菌和空載體轉化菌各100μl接種于4ml含100μg／mlAmp+抗性的LB液體培養基中，37℃振蕩培養過夜；分別取50μl新鮮菌液，轉接至50ml含40μg／LAmp的LB液體培養基中，37℃200r／min振蕩培養，至菌體A600值為0.5～0.6時，加入IPTG至終濃度為1mmol／L，200r／min振蕩培養，分別于3、4、5和6h收集1.5ml菌液，冰浴超聲破碎，10000×g離心10min，分別收集上清和沉淀，進行12%SDS-PAGE分析。

3表達產物的純化及鑒定

表達產物經12%SDS-PAGE分離后，將目的蛋白切膠后收集至透析袋中，120V水平電泳1h，待膠透明后，取出置PBS緩沖液中，4℃透析過夜，收集液體，用超濾離心管進行濃縮。取30μg純化的蛋白，電轉膜后，置5%脫脂奶粉室溫封閉1h；分別加入兔抗MSP1α和MSP1β多克隆抗體（均1∶100稀釋），37℃孵育1h；加入HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶5000稀釋），37℃孵育1h；DAB法顯色，蒸餾水洗滌，終止反應。重組蛋白多克隆抗體的制備用2只新西蘭白兔進行高免血清的制備，用2只商品蛋雞進行抗MSP1α和MSP1βIgY抗體的制備。將純化的重組蛋白100μg加等體積的完全弗氏佐劑進行初免，將純化的重組蛋白100μg加等體積的不完全弗氏佐劑進行2、3次免疫，每次免疫間隔14d。白兔經皮下注射接種，雞經肌肉注射接種。在末次免疫5d后，經白兔耳緣靜脈采血，分離血清，進行Westernblot鑒定，具體操作同1.8項。商品蛋雞從免疫前1周至末次免疫后2周，每日收集雞蛋，采用聚乙二醇沉淀法提取雞蛋中IgY抗體：將卵黃從卵清中分離出來，取10ml卵黃，加入100ml磷酸鈉鹽緩沖，再加入5ml氯仿，至有半固體狀物質出現后，10000×g離心，收集上清，加至5ml聚乙二醇中，10000×g離心，收集沉淀，重懸于磷酸鈉鹽緩沖液中，置-20℃保存備用。1和MSP1β蛋白在大腸埃希菌外膜表達的檢測采用間接熒光免疫法。取誘導表達的重組菌，經PBS（pH7.2）洗滌后，涂布固定至載玻片上，用含1%BSA的PBS37℃封閉60s；在分離的IgY抗體中孵育60s；PBS洗滌，加入FITC標記的兔抗雞IgG（1∶1000稀釋），37℃孵育30s；PBS洗滌，熒光顯微鏡下觀察，視野中呈現黃綠色熒光判為陽性。1.11MSP1α和MSP1β蛋白對牛紅細胞黏附作用的檢測用于血凝試驗和血凝抑制試的血液采自經PCR方法檢測A.marginale陰性的牛（來自黑龍江某集約化牛場）。抗凝血經PBS洗滌5次后，置含1%戊二醛的PBS中，4℃固定12h后，置含1.5mol／L疊氮化合物的PBS中備用；將約5×107個／ml的紅細胞加至約2×109個重組表達菌中，進行HA試驗，混勻，37℃振蕩溫育30min；PBS洗滌，重懸于等體積PBS，制作血細胞涂片，甲醇中固定15min，進行Giemsa染色，紅細胞凝集百分數通過對吸附到紅細胞上的細菌計數來確定。取免疫后分離的IgY抗體0.5ml，分別加至約2×109個誘導表達的重組菌中進行HI試驗，制備稀釋度為1∶2、1∶3和1∶5的IgY抗體，37℃溫育30min；將約5×107個紅細胞加至含1.5mol／L疊氮化合物的PBS中，37℃溫育30min；PBS洗滌，重懸于等體積PBS，制作血細胞涂片并計算紅細胞凝集百分數。

作者：倪宏波錢愛東姜海芳單位：黑龍江八一農墾大學