大鼠腦缺血保護機制分析論文

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【摘要】目的觀察腦心康片對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，進一步探討其作用機制。方法采用大鼠大腦中動脈線栓法制備不完全腦缺血模型，觀察腦心康片給藥前后大腦中動脈阻塞(MCAO)大鼠神經功能缺損導致的行為學變化；流式細胞術檢測腦心康片對MCAO模型大鼠急性腦損傷細胞凋亡的影響；免疫組織化學法檢測腦心康片對腦缺血后24，48，72h腦組織COX2蛋白表達的影響。結果大鼠腦缺血再灌注損傷后24，48，72h腦組織中COX2陽性細胞平均灰度值及神經元細胞凋亡率模型組與假手術組相比，差異有顯著意義（P<0.01）；給藥后腦心康高、中、低劑量組與銀杏葉片組相比，差異有顯著意義（P<0.01或P<0.05）；給藥后腦心康高、中、低劑量組與尼莫地平組相比，差異有顯著意義（P<0.01或P<0.05）。結論腦心康片對腦缺血具有保護作用，并遵循一定的時效關系和量效關系，其機制可能與降低缺血腦組織神經元的凋亡率，抑制COX2蛋白的表達有關。

【關鍵詞】腦心康片；腦缺血；再灌注損傷；細胞凋亡；COX2

腦血管疾病是神經系統的常見病、多發病，是目前引起人類死亡的三大疾病之一。缺血性腦卒中是多種原因引起的一種臨床病理狀態,其腦組織損害是產生臨床征象的病理基礎。在本病的預防、治療和康復方面，中醫藥具有較為顯著的療效和優勢［1］。臨床應用腦心康片治療腦缺血，取得滿意療效。本文旨在通過對大鼠腦神經損傷的行為學改變、細胞凋亡率和凋亡相關基因COX2蛋白表達的觀察，探討腦心康片對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用及其作用機制。現報道如下。

1材料

1.1動物Wistar大鼠，雄性，體質量（200±20）g，由黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：黑動字P00101006。大鼠自由進食、飲水，同等條件下飼養，手術前12h禁食，不禁水。

1.2藥品與試劑腦心康片由蝙蝠葛酚性堿50%、水蛭素50%組成，黑龍江中醫藥大學實驗中心制備。尼莫地平片，天津中央藥業有限公司生產。銀杏葉片，唐山榮大藥業有限公司生產。COX2抗體（COX2山羊抗兔IgG多抗）稀釋度：1:100，SantaCruz公司。HRP標記的鏈霉卵白素-親和素SP試劑盒、S/P兩步法檢測試劑盒、PV6001二步法檢測試劑盒、兔抗山羊IgG/HRP、山羊抗鼠IgG/HRP，DAB顯色試劑盒，均由北京中杉金橋生物技術有限公司生產。

2方法

2.1分組及給藥方法Wistar大鼠雄性70只，體質量（200±20）g，按照體質量隨機分為7組，每組10只。即腦心康片高劑量組（100mg/kg）、腦心康片中劑量組（50mg/kg）、腦心康片低劑量組（25mg/kg）、尼莫地平組（21.6mg/kg）、銀杏葉片組（135mg/kg）、模型對照組和假手術組（分別給等體積生理鹽水）。各組均連續灌胃給藥7d，末次給藥30min后手術。

2.2大鼠腦缺血再灌注模型制備采用大鼠大腦中動脈線栓法制備不完全腦缺血模型，末次給藥30min后，20%烏拉坦（1g/kg，ip）麻醉，分離并結扎雙側頸總動脈及迷走神經45min，然后松開再灌注2h。假手術組只暴露血管不結扎，其余組均按照上述過程操作。

2.3實驗指標的檢測方法在造模手術完成3～5h，待大鼠蘇醒后，能夠完全自主活動時，進行第1次神經功能評分；分別于末次給藥后24，48，72h進行第2次神經功能評分。行為學評分后處死動物，迅速取出大腦置于冰盤上。將大腦分成兩半，取左側大腦皮層腦組織2g制成單細胞懸液，檢測大鼠神經細胞凋亡率。取右側大腦制成1%的腦組織勻漿，采用免疫組織化學法檢測大鼠腦組織COX2蛋白表達。

2.4統計方法所有數據以±s表示，組間比較用t檢驗。

3結果

3.1腦心康片給藥前后各組大鼠神經功能缺損評分情況

結果見表1。表1各組大鼠神經功能缺損評分的基本情況（略）

由表1可見，模型組與假手術組相比，差異有顯著性意義（P<0.01），說明造模是成功的。經藥物治療后，藥物治療各組的大鼠神經功能缺損評分積分治療前與治療后比較，及藥物治療后的神經功能缺損評分積分與模型組的比較，均具有極顯著差異，P＜0.01，說明各治療藥物對腦缺血均具有顯著的治療作用，能明顯改善神經功能缺損，使大鼠因腦缺血導致的行為障礙得到部分改善，但還未達到完全恢復的程度，即與假手術組比較，P＜0.01。且72h腦心康片治療組的療效優于24h治療組（高劑量），差異顯著，P＜0.05，說明腦心康片對腦缺血的保護作用存在著一定的時效關系。

3.2腦心康片對細胞凋亡的影響

結果見表2。表2腦心康片對MCAO大鼠腦組織細胞凋亡的影響（略）

由表2可見模型組與假手術組比較有顯著性差異，P＜0.01，說明造模是成功的。所有藥物治療組與假手術組比較，均有顯著性差異，P＜0.01，與模型組比較差異亦顯著，P＜0.01或P＜0.05。假手術組腦組織的神經細胞可測得凋亡峰，即細胞凋亡率不為0，說明正常的腦組織亦有少量的凋亡現象發生。

實驗結果表明，腦心康片具有明顯的抗腦缺血作用，對神經元細胞凋亡具有明顯的抑制作用，隨劑量增加，此作用明顯增強。腦心康片高劑量抗腦缺血的作用要優于銀杏葉片，與尼莫地平作用相當，中劑量弱于尼莫地平，但與銀杏葉片作用相當，低劑量弱于尼莫地平和銀杏葉片。

3.3腦心康片對MCAO大鼠腦組織COX2表達的影響

結果見表3。表3腦心康片對MCAO大鼠腦組織COX2表達的影響（略）

由表3可見，經藥物治療后，各組的大鼠腦組織雖可見COX2陽性細胞表達，但與模型對照組比較，均具有極顯著差異，P＜0.01，說明各治療藥物對腦缺血均具有顯著的治療作用，能明顯抑制COX2表達，且腦心康片同一時間點的高、低劑量組比較差異顯著，P＜0.01；72h腦心康片治療組的療效優于24h腦心康片治療組（高劑量），差異顯著，P＜0.05，說明腦心康片對腦缺血的保護作用存在著一定的量效關系和時效關系。

實驗結果表明，在缺血早期，腦心康片具有明顯的抗腦缺血、抑制COX2表達的作用，并存在一定的量效關系及時效關系。

4討論

細胞凋亡是細胞接受導致凋亡的“信號”時，細胞內的蛋白質被激活，啟動內部自身基因調控機制，引起細胞自殺性死亡［2］。近年來日益增多的證據表明，神經元凋亡參與缺血性細胞損傷，并且是缺血引起選擇性神經元丟失的一種重要形式。腦缺血后，細胞因Glu受體過量激活、鈣超載、炎癥變化、OFR、線粒體和DNA損傷而表現出壞死或凋亡兩種死亡形式。在缺血中心區主要以壞死為主，而在缺血半暗帶以凋亡為主；輕度缺血主要引起細胞凋亡，嚴重缺血主要引起細胞壞死。局灶性腦缺血發生后神經元的死亡有兩種不同的方式：細胞壞死和細胞凋亡，并且兩種方式可以并存［3］。

環氧合酶（COX）是催化花生四烯酸合成前列腺素和血栓素的限速酶，能引起炎癥反應并導炎癥細胞毒性。其活性在控制前列腺素類物質的合成過程中有著重要作用。越來越多的證據表明COX參與了缺血性腦損傷，是核因子信號轉導的靶目標之一。在正常情況下，成年動物腦內不表達COX-2，在缺血和缺氧引起的炎癥反應中，COX2表達增高，主要在神經元和血管內皮細胞表達［4］。COX-2在神經組織中的表達可直接損傷神經元，并可能引起組織損傷和腦水腫［5］。由于COX2參與了腦缺血后神經元損傷的病理過程，因此阻斷或減少COX2激活，降低COX2表達，皆可減輕由caspase3介導的缺血性神經元損害。COX2抑制劑可顯著抑制缺血易損傷區COX2的活性，抑制神經細胞的凋亡，改善神經功能。

本實驗結果表明，腦心康片具有明顯的抗腦缺血作用，對神經元細胞凋亡具有明顯的抑制作用，隨劑量增加，此作用明顯增強。腦心康片高劑量抗腦缺血的作用要優于銀杏葉片，與尼莫地平作用相當，中劑量弱于尼莫地平，但與銀杏葉片作用相當，低劑量弱于尼莫地平和銀杏葉片；腦心康片具有明顯抑制缺血腦組織COX2表達的作用，減輕局灶性腦缺血時的炎癥反應及繼發引起的遲發性神經元損害作用，并存在一定的量效關系及時效關系。超級秘書網：

【參考文獻】

［1］丁正同，蔣雨平.臨床顱腦病學［M］.天津：天津科學技術出版社，2003：361.

［2］蔡豎平，桂秋萍，韓志濤，等.腦缺血-再灌注后海馬遲發性神經元死亡的實驗研究［J］.軍醫進修學院學報，2002，23（4）：268.

［3］吳偉，史繼新.腦缺血再灌注損傷后神經元損傷機制及治療研究進展［J］.中國微循環，2003，7（6）：391.

［4］NogawaS，ZhangF，RossME,etal.Cyclooxygenase2geneexpressioninneuronscontributestoischemicbraindamage［J］.Neurosci,1997,17(8):2746.

［5］劉宏，吳平生.全腦缺血再灌注后發生遲發性神經元死亡的機制［J］.國外醫學·生理、病理科學與臨床分冊，1999，19（5）：379.