分離大黃酚

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【摘要】目的研究大黃酚和大黃素甲醚混合物的高效分離方法。方法采用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，薄層色譜跟蹤檢測(cè)，HPLC檢測(cè)產(chǎn)品純度。結(jié)果在以工業(yè)級(jí)柱層析硅膠（100～200目）為填充劑的色譜柱上，以石油醚乙酸乙酯甲酸(體積比100∶1∶0.5)為洗脫劑，可以將大黃酚和大黃素甲醚完全分離。結(jié)論硅膠柱色譜可以實(shí)現(xiàn)大黃酚和大黃素甲醚的高效分離；產(chǎn)品經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度達(dá)99%以上。

【關(guān)鍵詞】柱色譜法；大黃酚；大黃素甲醚

Abstract:ObjectiveTostudytheefficientandsimplemethodofseparationofchrysophanolandphyscion.MethodsUsingsilicagelcolumnchromatographyforseparation,TLCfortrackinganddetection,HPLCforpuritydetectionoftheproducts.ResultsChrysophanolandphyscioncouldbecompletelyseparatedbyindustrialsilicagelcolumnchromatography［100～200mesh,petroleumetherethylacetateformicacid(100∶1∶0.5)aselute］.ConclusionChrysophanolandphyscioncouldbeeffectivelyseparatedbysilicagelcolumnchromatography.Theirpuritieswere≥99%byHPLCmethod.

Keywords:columnchromatography；chrysophanol；physcion

大黃(RheumofficinaleBaill.)為常用中藥,具有瀉下、抗菌、抗腫瘤、抗高脂血癥、降低血壓、健胃、利膽、保肝、強(qiáng)心、消炎、延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫等作用［1］。大黃的主要有效成分是其中的5種游離蒽醌類化合物（見(jiàn)圖1），例如，大黃酸具有抗腫瘤、抗炎、抗菌及調(diào)節(jié)腎功能等作用［2］；大黃素具有抑菌、抗炎、保護(hù)肝腎、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抗癌等作用［3］；蘆薈大黃素具有清除氧自由基、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等作用［4］；大黃素甲醚可通過(guò)血腦屏障，具有很強(qiáng)的抗炎作用［5］；大黃酚具有抗衰老作用、止血作用［6］。大黃酸、大黃素和蘆薈大黃素可以通過(guò)簡(jiǎn)單的pH梯度萃取法和重結(jié)晶得到單體，而大黃酚和大黃素甲醚在植物體內(nèi)常共同存在，它們結(jié)構(gòu)相似，酸性與極性相近，分離很困難。大黃酚和大黃素甲醚不僅具有較好的藥理活性，而且大黃酚通過(guò)氧化反應(yīng)可以轉(zhuǎn)化為大黃酸，通過(guò)鹵代和水解反應(yīng)可以轉(zhuǎn)化為蘆薈大黃素；大黃素甲醚通過(guò)脫甲基化反應(yīng)可以轉(zhuǎn)化為大黃素。因此，大黃酚和大黃素甲醚單體的簡(jiǎn)單獲取具有重要意義。我們?cè)诖簏S的綜合深加工研究中，得到了大量大黃酚和大黃素甲醚的混合物，并通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)探索，找出了一種快捷、簡(jiǎn)單、高效的分離方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

圖1大黃中5種主要游離蒽醌類化合物的結(jié)構(gòu)式（略）

Fig.1ThestructuresoffivemainactiveanthraquinonesofRheumofficinale

1儀器與試劑

1.1儀器

RE52cs旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市英峪予華儀器廠）；電子恒溫水浴鍋（深圳市國(guó)華儀器廠）；SHBⅢ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2試劑

大黃酚和大黃素甲醚混合物（自制，從大黃中分離得到）；柱層析硅膠（工業(yè)級(jí)，100～200目，青島海洋化工廠）；薄層層析硅膠G（化學(xué)純，青島海洋化工廠）；石油醚、乙酸乙酯、三氯甲烷等均為分析純（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；大黃酚和大黃素甲醚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

2方法與結(jié)果

2.1薄層硅膠板的制備

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3％的羧甲基纖維素鈉(CMCNa)水溶液，與薄層層析硅膠G粉，按3mL∶1g的比例配制調(diào)漿，以載玻片作為載體鋪板，鋪好后晾干，于105℃下活化1h，放入干燥器中，備用。

2.2色譜柱的制備

取一根內(nèi)徑和長(zhǎng)度合適的玻璃層析柱，用洗脫劑濕法裝柱，用手輕敲柱子，使硅膠裝填結(jié)實(shí)且頂端平整，有效柱長(zhǎng)控制在20cm左右，硅膠用量為樣品量的200倍。

2.3樣品的制備

大黃酚和大黃素甲醚的混合物用最少量的三氯甲烷溶解，再加入適量硅膠拌樣（硅膠∶樣品=20∶1，質(zhì)量比），待氯仿?lián)]發(fā)干后均勻鋪于柱頂。

2.4洗脫

以石油醚（60～90℃）乙酸乙酯甲酸(體積比100∶1∶0.5)為洗脫劑，進(jìn)行洗脫，洗脫液減壓濃縮后可循環(huán)利用。

2.5色譜帶的定位

洗脫一定時(shí)間后可以看見(jiàn)兩段明顯的色譜帶，洗脫得快的那一段為大黃酚，較慢的那一段為大黃素甲醚。繼續(xù)洗脫，分別得到橙紅色顆粒狀結(jié)晶（大黃酚）和橙黃色針狀結(jié)晶（大黃素甲醚）。

2.6薄層色譜鑒定

取制備好的薄層硅膠板，以石油醚乙酸乙酯甲酸（體積比10∶1∶0.5）為展開(kāi)劑，以對(duì)照品作對(duì)照，確定橙紅色顆粒狀結(jié)晶為大黃酚，橙黃色針狀結(jié)晶為大黃素甲醚。

2.7大黃酚和大黃素甲醚純度的HPLC檢測(cè)方法(歸一化法)

色譜柱為DiamonsilC18(250mm×4.6mm，5μm)，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL，流動(dòng)相為甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的磷酸溶液(體積比85∶15)，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。檢測(cè)結(jié)果表明大黃酚純度為99.01%，大黃素甲醚純度為99.06%。色譜圖見(jiàn)圖2、3。

圖2大黃酚的HPLC圖（略）

Fig.2HPLCofchrysophanol

圖3大黃素甲醚的HPLC圖（略）

Fig.3HPLCofphyscion

3討論

3.1大黃酚和大黃素甲醚的分離研究，國(guó)內(nèi)已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道：將樣品先用經(jīng)預(yù)處理的一定粒度的磷酸氫鈣柱層析，然后用苯［7］或石油醚［8］洗脫，但此操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，且苯的毒性較大；用纖維素柱層析易于分離、洗脫劑較單一(水飽和石油醚)，但纖維素粉制備費(fèi)時(shí)［9］；也有人用薄層硅膠常壓濕柱層析，然后用石油醚丙酮或石油醚乙酸乙酯(體積比15∶1)［10］洗脫，雖然洗脫速度很快，但兩者的分離度不是很理想。本文用工業(yè)級(jí)柱層析硅膠（100～200目）作柱層析進(jìn)行分離，可在較短時(shí)間內(nèi)獲得完全分離，方法有效，簡(jiǎn)便，且洗脫劑可以循環(huán)使用，節(jié)省試劑。

3.2裝柱技術(shù)和加樣技術(shù)可直接影響分離效果，宜采用較低活性的吸附劑，如硅膠的活性在Ⅱ～Ⅲ級(jí)較好，對(duì)于高活性的吸附劑預(yù)先用10％的展開(kāi)劑進(jìn)行飽和，否則在展層過(guò)程中，溶劑前沿不易整齊，影響層帶分離；加樣時(shí)，一定要均勻地平鋪于柱頂，否則會(huì)出現(xiàn)層帶交叉現(xiàn)象。

3.3鐵離子能與大黃素甲醚生成絡(luò)合物，于50℃熱結(jié)構(gòu)易破壞。因此，在用硅膠柱層析法分離大黃素甲醚和大黃酚的過(guò)程中，應(yīng)避免與鐵離子的接觸，特別需要控制硅膠中的鐵含量，含鐵量低于0.02％的層析硅膠影響較小。

3.4大黃酚和大黃素甲醚混合物的上樣量一般為0.2g，量再增加就不能使它們完全分離［11］，而本文的上樣量達(dá)到5g,且能得到完全分離。

3.5大黃酚和大黃素甲醚屬于蒽醌類化合物，酚羥基呈弱酸性，本實(shí)驗(yàn)在柱層析洗脫劑和薄層展開(kāi)劑中加入少量酸，目的是為了防止大黃酚和大黃素甲醚產(chǎn)生拖尾，從而使分離效果更佳。

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