肺癌增殖論文：WT1與肺癌增殖的關(guān)聯(lián)淺析

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本文作者：徐彩華吳晨陳亦江作者單位：南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院胸心外科

非小細胞肺癌組織中wt1mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，在79例非小細胞肺癌組織中，WT1mRNA的相對表達量（4.5×10－3）是相應癌旁組織相對表達量（1.7×10－3）的2.6倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖1）。

成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1經(jīng)PCR和0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得片段大小正確（1500bp）的克隆（圖2）。挑選PCR鑒定正確的克隆進行測序，測序結(jié)果證明與GenBank數(shù)據(jù)庫中WT1（NM_024426.4）比對正確，表明重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1構(gòu)建成功。

蛋白質(zhì)印跡法檢測重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1轉(zhuǎn)染后H1299細胞中WT1蛋白的表達

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1轉(zhuǎn)染后24、36、48和60h，pLV-GFP-WT1轉(zhuǎn)染組細胞中WT1蛋白表達水平明顯高于對照組和Lipo組（圖3），說明高表達WT1的肺癌H1299細胞構(gòu)建成功。

WT1促進非小細胞肺癌H1299細胞的增殖

CCK-8檢測結(jié)果顯示，WT1過表達組在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24、36和48h時的D值高于對照組（P＜0.05），對照組和Lipo組細胞在每個時間點的D值之間無明顯差異（P＞0.05）。從質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24h開始，WT1過表達組細胞的細胞增殖率開始增加（17.6%）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后36h，WT1過表達組細胞的細胞增殖率達到最高（28.3%）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后48h，WT1過表達組細胞的細胞增殖率有所下降（21.1%）；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后60h，WT1過表達組細胞的增殖率（7.9%）進一步下降（表1）。

本研究發(fā)現(xiàn)，WT1在非小細胞肺癌組織中的表達量顯著高于相應癌旁組織，其高表達能顯著促進非小細胞肺癌的增殖，并在非小細胞肺癌中扮演癌基因的角色。

WT1基因定位于染色體11p13q上，是一個非常重要并有多種功能的基因[11,12]。它首先作為腫瘤的抑癌基因被發(fā)現(xiàn)，也是最為人熟知的抑癌基因之一。但很多證據(jù)證明，它在某些腫瘤中作為癌基因存在[13-15]。比如：WT1在白血病、乳腺癌和惡性間皮瘤等中高表達[14,16-18]。同時，Vicent等[9]發(fā)現(xiàn)，無論是在人肺癌細胞還是小鼠肺癌細胞中，WT1的缺失降低了細胞的增殖，但對細胞凋亡的影響非常小，他們認為WT1的缺失和WT1高表達可能帶來的是截然不同的結(jié)果。

本研究收集了79例非小細胞肺癌及其相應癌旁組織標本，并對其進行了實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT1mRNA在非小細胞肺癌組織中的表達水平明顯高于相應的癌旁組織（P＜0.01），說明非小細胞肺癌的發(fā)生與WT1基因有著密切的關(guān)系，WT1基因高表達可能會促進肺癌組織的生長，與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。這對肺癌患者的預后是不利的。

本研究將重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1轉(zhuǎn)染至非小細胞肺癌H1299細胞中，對轉(zhuǎn)染后的細胞增殖情況進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pLV-GFP-WT1后24、36和48h的H1299細胞，其增殖率高于對照組，36h時細胞增殖率最高達28.3%，36h后細胞增殖率逐漸下降。筆者推測，這種現(xiàn)象可能是由于脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法并沒有把目的基因融合到宿主基因組中，轉(zhuǎn)染剛開始WT1基因在細胞中的表達量逐漸增加，對細胞增殖的作用也相應增加，在轉(zhuǎn)染后36h達到頂峰；但隨著細胞分裂，WT1基因在細胞內(nèi)逐漸丟失，細胞內(nèi)表達量下降，導致細胞增殖率下降。

本研究通過臨床標本檢測和體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，WT1基因在非小細胞肺癌中表達水平較高，對非小細胞肺癌H1299細胞的生長起促進作用，WT1基因在非小細胞肺癌中扮演著癌基因的角色。本研究小組后續(xù)將進一步研究WT1基因?qū)Ψ切〖毎伟┦欠翊嬖诳沟蛲鲎饔靡约癢T1基因在裸鼠體內(nèi)的成瘤情況。相信在不遠的將來，也許WT1基因?qū)裆掀どL因子一樣，成為非小細胞肺癌診斷和治療的一個新靶點。