胃癌增殖論文：PKGⅡ?qū)ξ赴┰鲋车囊种谱饔?/h1>
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pkgⅡ?qū)GF引起的SGC-7901細(xì)胞增殖有抑制作用
MTT檢測結(jié)果顯示，Ad-PKGⅡ＋8-pCPT-cGMP＋EGF組細(xì)胞的D值明顯低于Ad-PKGⅡ＋EGF組和Ad-LacZ＋EGF組（P＜0.01），與Ad-LacZ組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。這說明EGF處理后，明顯增強(qiáng)了SGC-7901細(xì)胞的增殖能力，用8-pCPT-cGMP作用Ad-PKGⅡ感染的細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖活性明顯降低，結(jié)果表明PKGⅡ顯著抑制了胃癌細(xì)胞的增殖（圖1）。
PKGⅡ?qū)GF誘導(dǎo)的p-RSK1的核轉(zhuǎn)錄有抑制作用
蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，8-pCPT-cGMP作用Ad-PKGⅡ感染的SGC-7901細(xì)胞后，PKGⅡ顯著抑制了EGF引起的RSK1磷酸化水平的升高。同時(shí)檢測細(xì)胞核內(nèi)p-RSK1（Ser380）的結(jié)果表明，PKGⅡ顯著抑制了p-RSK1向細(xì)胞核內(nèi)移位（圖2A）。免疫熒光檢測結(jié)果（圖2B）顯示，EGF處理后，SGC-7901細(xì)胞核內(nèi)有大量p-RSK1（Ser380）的累積；經(jīng)8-pCPT-cGMP預(yù)處理后，EGF誘導(dǎo)的細(xì)胞核內(nèi)p-RSK1（Ser380）的累積大幅度減少，與蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果一致。
PKGⅡ抑制EGF誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞中c-Fos和c-JunmRNA及蛋白的表達(dá)
RT-PCR檢測結(jié)果顯示，EGF作用SGC-7901細(xì)胞后c-Fos和c-JunmRNA的表達(dá)水平較Ad-LacZ組明顯增加；在Ad-PKGⅡ感染的細(xì)胞中加入8-pCPT-cGMP后，c-Fos和c-JunmRNA的表達(dá)水平低于Ad-LacZ＋EGF組（圖3A）。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，EGF可明顯上調(diào)SGC-7901細(xì)胞中c-Fos和c-Jun蛋白的表達(dá)；在Ad-PKGⅡ感染的細(xì)胞中加入8-pCPT-cGMP后，c-Fos和c-Jun蛋白的表達(dá)水平下調(diào)（圖3B）。
EGF通過與細(xì)胞表皮生長因子受體特異性結(jié)合，引起靶細(xì)胞內(nèi)一系列生物效應(yīng)，控制著細(xì)胞的增殖、分化和癌變。研究表明，胃癌細(xì)胞中EGF及EGFR過度表達(dá)，對(duì)胃癌的發(fā)生和發(fā)展有一定作用，而且二者還可刺激某些癌基因的擴(kuò)增[9,10]。本研究結(jié)果顯示，Ad-PKGⅡ組對(duì)EGF刺激引起的胃癌細(xì)胞增殖無明顯的影響，但經(jīng)8-pCPT-cGMP激活PKGⅡ后，即可明顯抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞的增殖活性。
MAPK介導(dǎo)的信號(hào)通路具有調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)控細(xì)胞周期以及維持細(xì)胞生存等生物活性，在腫瘤的發(fā)生中有重要的調(diào)控作用。EGF及EGFR是MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要啟動(dòng)者，EGFR磷酸化，活化小G蛋白，進(jìn)而使絲/蘇氨酸激酶Raf和MEK激活，再特異性地激活MAPK中的ERK，最終通過調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子[如Elk-1和激活蛋白等]的活性而調(diào)控基因表達(dá)[11]。本研究結(jié)果表明，PKGⅡ?qū)GF誘導(dǎo)的ERK下游的信號(hào)分子RSK和原癌基因的表達(dá)均有抑制作用。
哺乳動(dòng)物中RSK家族已得到證實(shí)的有4個(gè)成員（RSK1、RSK2、RSK3和RSK4），它們的典型特征是含有2個(gè)不同的功能性激酶結(jié)構(gòu)域和羧基端ERKs結(jié)合結(jié)構(gòu)域[12,13]。RSK1～3可以被MAPKs磷酸化所激活，也可以通過自身磷酸化激活。RSK在被MAPK磷酸化激活時(shí)，由Ras、Raf、MEK和MAPK/ERK信號(hào)通路所介導(dǎo)。SK激酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)外的幾個(gè)位點(diǎn)（包括Ser380、Thr359、Ser363和Thr573）的磷酸化都對(duì)RSK激酶活性的激活非常重要。ERK磷酸化RSK1的C-末端激酶結(jié)構(gòu)域Thr573，進(jìn)而使Ser363和Ser380位點(diǎn)磷酸化，最終完成整個(gè)RSK1分子的活化[14,15]。本研究選取受ERK激活通路調(diào)節(jié)的磷酸化位點(diǎn)Ser380，觀察在EGF刺激下，PKGⅡ?qū)ξ赴㏒GC-7901細(xì)胞中RSK1活性調(diào)節(jié)的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在EGF刺激下，RSK1Ser380位點(diǎn)的磷酸化水平升高，明顯高于Ad-LacZ對(duì)照組；激活后的PKGⅡ則抑制了p-RSK1（Ser380）和核轉(zhuǎn)錄。因此，筆者推測，PKGⅡ是通過ERK依賴的蛋白激酶通路來抑制RSK1的活性，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。當(dāng)然，為了明確RSK1激活的分子機(jī)制，還需要應(yīng)用ERK通路的抑制劑或激動(dòng)劑進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基因調(diào)控中，原癌基因c-Jun和c-Fos尤為重要，易受外界刺激，二者結(jié)合組成Ap-1復(fù)合體[6]。c-Jun和c-Fos的表達(dá)增強(qiáng)并且共同表達(dá)，有可能是細(xì)胞不斷增殖的觸發(fā)點(diǎn)，它們相互作用并影響其他基因的表達(dá)，使細(xì)胞最終增殖失控發(fā)生癌變[16]。為了進(jìn)一步研究PKGⅡ?qū)RK下游信號(hào)分子的作用，本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法和RT-PCR法對(duì)Ap-1的主要組成因子c-Fos和c-Jun進(jìn)行了蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平的檢測，結(jié)果表明在感染并激活的PKGⅡ細(xì)胞中，c-Jun和c-Fos的表達(dá)無論在蛋白水平還是mRNA水平均明顯低于Ad-LacZ＋EGF組，提示PKGⅡ可能通過抑制c-Fos和c-JunmRNA及蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制Ap-1形成。Jun及Fos基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞核，目前已知有3種Jun蛋白（c-Jun、JunB和JunD）及4種Fos蛋白（c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2）[17,18]。本研究只檢測了PKGⅡ?qū)-Jun和c-Fos的作用，PKGⅡ?qū)un和Fos家族其他成員的蛋白和mRNA的表達(dá)是否也有影響，尚有待進(jìn)一步研究。
研究顯示，用編碼PKGⅡ的腺病毒感染胃癌細(xì)胞，導(dǎo)致PKGⅡ高表達(dá)，經(jīng)8-pCPT-cGMP作用使其激活，可明顯抑制EGF誘導(dǎo)的MAPK/ERK激活，使細(xì)胞增殖受到明顯抑制[7]。結(jié)合本研究結(jié)果，筆者推測在胃癌發(fā)生過程中，PKGⅡ通過抑制ERK，抑制依賴ERK下游的重要激酶RSK1Ser380位點(diǎn)的活化，進(jìn)而作用于c-Jun和c-Fos，減弱其蛋白的合成以及降低其mRNA的表達(dá)，使胃癌細(xì)胞的增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受到抑制，從而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。
