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生物反應器可以控制和監測培養條件(如pH值、溫度、壓力、營養供應、廢物清除等),是用來進行生物反應或生化反應的動態三維細胞培養裝置[3]。與二維或靜態培養方法相比,生物反應器具有諸多優勢:①細胞培養周期短,無需多次換液;②通過各種機械刺激可增強種子細胞活性,誘導細胞分泌大量細胞外基質以緊密結合細胞支架;③生物反應器中形成的三維組織工程器官在各個方向上受力均勻,可減少傳代擴增引起的細胞表型缺失[4],增強抗壓力負荷性能[5]。
1生物反應器中的生物物理因素
1.1氧濃度
氧氣是軟骨內環境穩態的重要因素,人關節軟骨外表面所受的氧分壓為7%~10%,關節內層軟骨中的氧分壓約為1%[6]。間質來源的軟骨祖細胞凝集形成間質始基標志著軟骨形成的開始,而該過程需要在一個相對低氧環境中進行。因此,氧氣在軟骨形成中的作用成為了研究熱點。研究表明,當組織工程軟骨處于低氧環境下,其表現的生化特性與自體軟骨類似[7-9]。Meyer等[10]研究發現,在豬MSCs向軟骨分化過程中,低氧濃度是比動態壓力更有效的促分化劑。Schrobback等[11]深入研究了低氧濃度促進軟骨生成的機制,即常氧狀態下,低氧誘導因子2α(hypoxiainduciblefactor2α,HIF-2α)亞基在細胞質中穩定表達,而HIF-1α亞基在翻譯后即被細胞內氧依賴性泛素蛋白酶水解復合體降解,因此在正常氧飽和度下的細胞中基本檢測不到HIF-1α亞基的表達;而在低氧狀態下,HIF-1α亞基降解被抑制,1α和2α亞基形成有活性的HIF-1,HIF-1則轉移至細胞核內調節多種基因的轉錄。Terkhorn等[12]研究發現,缺氧環境(5%)可促進HIF-3α基因表達,而HIF-3α的作用是抑制HIF-1α和HIF-2α的表達水平,使得HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α、HIF-1處于穩定的高表達反饋調節平衡。綜上研究,低氧濃度有利于軟骨細胞分化、增強細胞活性已達成共識,且在該環境中,細胞的濕重和軟骨生成基因表達均顯著增加。但影響MSCs轉化為軟骨細胞及增殖的相關因素復雜,在生物反應器中促軟骨形成的最適氧濃度仍需進一步研究。
1.2靜水壓
有學者認為,軟骨承受著由人體日常活動產生的間歇性靜水壓,如在軟骨細胞培養中引入靜水壓及其他一些機械載量,可能會增加體外組織工程軟骨的基質合成[13]。關節軟骨承受的相關機械載量中,靜水壓是最重要的載量[14]。Ogawa等[15]通過對軟骨在靜水壓0~0.5MPa、0.5Hz和標準大氣壓環境下的組織學、免疫組織學、基因表達特性進行比較,發現靜水壓組聚集細胞基質的速度更快,細胞衰老變緩,而且在培養2周后軟骨特有基因表達明顯增強。因此,他們認為靜水壓既可增強細胞基質積累,又可刺激軟骨特有基因表達。但該實驗未進一步研究最適靜水壓。有研究提出,7~10MPa的間歇性靜水壓是組織工程軟骨體外培養的理想靜水壓[13,16]。同時,靜水壓越大,氧分壓越大,嚴格控制靜水壓即可影響氧分壓,進而改變氧濃度[13],間接影響軟骨細胞的分化及增殖。但較高壓力會降低培養液中CO2濃度,也會影響細胞生長。Jeong等[17]設計了一種電腦控制式反應器測定間歇性靜水壓對BMSCs向軟骨細胞分化的影響,實驗分為5組:0.2MPa組、0.1MPa組、0.05MPa組、0.02MPa組、空白對照組,結果發現0.1MPa靜水壓作用明顯,0.2MPa其次。目前,理想的靜水壓數值尚未達成一致,綜合前述研究,以0.1MPa間歇性靜水壓對BMSCs向軟骨細胞分化的作用效果最為理想。
1.3壓縮力
Takahashi等[18]研究發現,靜態壓縮力可以促進軟骨生成和分化。學者們進一步研究發現,動態壓縮力促進軟骨生成效果較靜態壓縮力更顯著[19-21];而且在BMSCs培養中,動態壓縮力使得軟骨分化標記物表達更多[22-24]。這與關節軟骨日常功能一致,因關節軟骨日常活動時產生的即是動態壓縮力。Huang等[25]研究表明,兔BMSCs-瓊脂糖復合體形變壓縮(4h/d、10%壓縮強度、1Hz)后,在存在與不存在TGF-β1的條件下Ⅱ型膠原及蛋白聚糖基因表達均明顯增強,此外TGF-β1受體在壓縮1h后明顯上調,也進一步促進了TGF-β1的軟骨化誘導作用。Richardson等[26]研究發現,在3h/d、10%壓縮強度、1Hz的壓縮條件下,培養第5天可見到BMSCs復合體中氨基聚糖含量增加。而類似研究也發現,4h/d加載后的氨基聚糖含量顯著高于2h/d的加載方式[24-25]。表明蛋白聚糖基因的表達隨著載荷時間增加而增強[23]。Hoenig等[27]評估了不同動態壓縮強度(5%、10%、20%壓縮強度,3000r/d,1Hz)對種植了原代豬軟骨細胞的脫細胞支架的短期影響,結果顯示20%壓縮強度對軟骨機械性能的影響最強,提示接受更高負荷強度預處理的組織工程軟骨更堅硬、更符合臨床要求。但該研究結果缺少更大壓縮強度實驗結果,尚不能說明20%壓縮強度以上(如30%、40%等)情況下得到的軟骨是否仍滿足臨床要求或性能下降,均需進一步研究。孫明林等[28]進一步研究了10%~30%壓縮強度下獲得的組織工程軟骨性能,發現在0.4Hz、20%壓縮強度、3h滾壓時間的滾壓參數下,BMSCs能更好地向軟骨細胞分化以及維持軟骨細胞表型。Huang等[29]研究認為,在生物反應器中持續應用動態壓縮力將改善BMSCs來源的軟骨結構機械性能。Thorpe等[30]觀察了TGF培養條件下,動態壓縮力對BMSCs軟骨生成的影響,發現培養42d后樣本中蛋白聚糖、黏多糖和Ⅱ型膠原蛋白的表達比單純動態壓縮力培養下更高。
1.4剪切負荷
不同類型生物反應器中,剪切力大小各不相同。如攪拌式反應器系統和直接灌流式反應器系統中為高剪切力,旋轉壁式反應器系統中為低剪切力[13]。由于剪切力對軟骨內環境穩態有顯著影響,了解剪切力類型至關重要。如高剪切力用于軟骨細胞培養會產生骨性關節炎特性表達,即可誘導產生環氧化酶2、前列腺素和IL-6[31-32]。還有研究發現高剪切力可誘導炎性介質釋放,使得軟骨細胞基質分泌減少,導致軟骨細胞凋亡[33]。謝甲琦等[34]研究了剪切力對MSCs的作用,發現適度的剪切力(3dyn/cm2)可以促進MSCs生長,過低的剪切力(1dyn/cm2)對MSCs生長無明顯影響,過高的剪切力(>8dyn/cm2)則抑制MSCs生長并加速細胞死亡。同時,他們首次提出了對MSCs進行增加剪切力訓練的概念,即漸進性增加的剪切力比恒定高剪切力更容易被細胞耐受,使細胞活力增強、存活比例增加、促進細胞增殖和轉化。該研究也為生物反應器中剪應力的標準化提供了重要依據。對于軟骨組織工程生物反應器系統中的剪切力最適值目前尚無統一標準,可選擇初始值為3dyn/cm2,漸進性增加至8dyn/cm2,以增強軟骨細胞對較高剪切力的適應能力和細胞活性,有利于細胞增殖,但尚需進一步研究明確。
2展望
綜上述,在軟骨組織工程生物反應器系統中,其生物物理因素的最適參數可能不是固定值,而是一個隨著種子細胞轉化、增殖而動態變化的漸變性參數。隨著組織工程研究的深入、自動化計算機技術以及材料技術的提高,可實現對生物反應器生物物理因素的精確動態控制,建立即時控制反饋系統,選擇最優調控方案。未來生物反應器發展的方向必須遵循工程化原則,規范質量監控、自動化、標準化和生產過程及組織工程器官的安全性[35],實現其臨床轉化應用。
作者:葉鋼章方彪史宏燦單位:揚州大學醫學院胸外科